癌症研究经验谈2：靶向重测序实现了体细胞嵌合的高通量检测

Saumya Jamuar博士是新加坡KK妇女儿童医院的临床遗传学家，也是Global Gene公司的联合创始人，这是一家创新的基因组学研究开发公司。他开创了第一种高通量的系统方法来鉴定与大脑皮质畸形相关的体细胞突变。他利用NGS开展此项研究，使用的是Illumina的MiSeq系统和TruSeq® Custom Amplicon assay。

引言

许多癌症都鉴定出体细胞突变，它导致有着不同基因型的2个或更多的细胞亚群出现。然而，尽管体细胞突变在遗传性疾病中的作用已经获得共识，但它们在神经发育疾病中的流行状况一直到最近才得以系统评估。

过去，遗传变异的鉴定是通过毛细管电泳（CE）/Sanger测序来实现的。不过，这个反复的过程不仅耗时耗力，其检测极限也不足以鉴定稀有变异。新技术，如新一代测序（NGS），让科学家能够扩大他们的研究范围，并缩短探索之路。

Saumya Jamuar博士是新加坡KK妇女儿童医院的临床遗传学家，也是Global Gene公司的联合创始人，这是一家创新的基因组学研究开发公司。他开创了第一种高通量的系统方法来鉴定与大脑皮质畸形相关的体细胞突变。他利用NGS开展此项研究，使用的是MiSeq系统和TruSeq® Custom Amplicon assay。

iCommunity与Jamuar博士对话，讨论这个靶向重测序集合的开发，以及他如何利用NGS改善人类健康。

Q：您为什么做一名医生？

Saumya Jamuar（SJ）：医生这种职业让人能够改变其他人的生命，以非常直接的方式，在他们最脆弱的时间点。作为一名儿科医生，我总觉得医治儿童是很有挑战性的，但在问诊结束时听到一句“谢谢”，又让我十分满足，尤其是他们感觉好多了。这份喜悦和工作满足感推动着我的整个工作。

Q：什么促使您在行医的同时还追求科学研究？

SJ：我在新加坡完成了儿科住院医师实习，接着获得了政府资助的哈佛医学院的遗传学研究员职位。在完成这项工作后，我留在哈佛，在Christopher Walsh博士的实验室开展博士后工作。在那里我从一名医生变成了临床科学家。我认识到，在诊所中，我每次只能帮助一名患者。然而，在实验室中，通过开展影响人类健康的研究，我可以帮助更多的患者。

我意识到转化研究还有巨大的鸿沟。转化研究并非与基础科研或临床试验同步，而基础科研在患者保健上的应用也缺乏。我的临床医学背景和Walsh实验室的基础研究能力让我有了绝佳的机会来实践转化医学。从那时起我逐渐熟悉Illumina。

Q：您在Walsh的实验室开展哪种类型的研究？

SJ：我一直对神经疾病感兴趣，特别是大脑发育以及这个过程中的错误如何导致脑畸形。Walsh教授是一位神经学家，在脑畸形遗传学和神经精神疾病领域是领先者，因此Walsh实验室特别适合我。我的项目旨在开发出一种系统方法来研究脑畸形中的体细胞突变。

Q：Walsh实验室是否使用Illumina的系统和产品？

SJ：他的实验室并未购入Illumina的系统。他们的测序是在核心或服务实验室开展的。他们将测序样品送到不同的供应商，其中一些使用Illumina的技术。作为我项目中背景工作的一部分，我了解了不同产品的信息，包括Illumina的TruSeq Custom Amplicon、Agilent的HaloPlex和Ion Torrent的扩增子测序等，当时是2012年。这是我考虑的3个，在深思熟虑之后，我决定使用TruSeq Custom Amplicon。

Q：您选择TruSeq Custom Amplicon的原因有哪些？

SJ：一个原因是设计实验和定制集合相对轻松。当我利用DesignStudio™软件检验TruSeq Custom Amplicon时，这个过程相当简单。我输入基因名称，指定外显子-内含子边界有多少侧翼序列。两天之后，我就拿到了最符合我要求的设计。之后还有一些其他步骤来优化集合，这个过程也很简单。

第二个原因是Illumina技术名声在外。当我与熟悉不同技术的人交谈时，他们都建议我使用Illumina的技术，因为数据质量很可靠。最终，我们进行得很顺利。

Q：在NGS以前的日子里，你将使用Sanger测序来开展这项研究。当时，Sanger测序在鉴定突变上有何优势？

SJ：实际上，利用Sanger测序来检测变异没什么优势。这是一个漫长的过程，因为Sanger测序是挨个基因进行的。有时，实验室要测序许多基因，但没有获得任何结果。有了NGS，我们能够将感兴趣的基因放在一个集合、一个反应中，并等待结果。

此外，Sanger测序的检测极限大约是15-20%的体细胞变异。在尝试检测嵌合时，我们发现这些变异的比例低至5%，而Sanger测序没办法检测到2。根据我们的校准样品，利用TruSeq Custom Amplicon，我们能够轻松检测嵌合，而理论检测极限低至1% 。与Sanger测序相比，这是一个相当简单的过程。十几年来，研究人员一直在尝试系统检测嵌合。有了TruSeq Custom Amplicon集合和MiSeq Reporter软件，我能够在一周内鉴定那些嵌合变异。NGS将嵌合变异的检测转变成一个非常高效的过程。

然而，那些嵌合变异的验证需要更长时间。我们必须证明，变异是真实存在的，而不是测序错误。我们对单个亚克隆进行Sanger测序，又花了6个月才完成。低频率变异的验证仍然是个问题，不同的实验室采用替代方法来验证低于30%的变异。

Q：您为什么专门研究体细胞嵌合和脑畸形？

SJ：Walsh实验室在编码doublecortin的DCX基因中发现了嵌合的证据，它导致双皮层（DC）综合征和X连锁无脑回畸形（XLIS），从字面意义上说是“平滑脑”畸形。患有无脑回畸形的儿童通常神经上受到损害；他们可能伴有癫痫、发育迟缓、喂养问题以及吸入性肺炎。

脑畸形很容易通过结构成像（如MRI）来鉴定。人们可以看到无脑回畸形的大脑中缺乏脑沟和脑回。不过DC是一种谱系障碍；一些个体患有癫痫，但做得很好。他们并没有发育迟缓。MRI可能显示一些类似无脑回畸形的改变，但并不完全。这是由于神经元的细胞自主性。缺乏突变的神经元将按照预期生长和迁移，形成正常的皮层。带有DCX突变的神经元将表现出迁移缺陷，它们在正常皮层之下形成神经元的异位带，因此称为“双皮层”。放射学研究发现大脑中的嵌合显而易见，但问题仍然存在。它有多严重？在成像确定脑畸形的家庭中，有多少家庭实际上带有嵌合，但Sanger测序错过了？

Q：通过使用TruSeq Custom Amplicon，您如何阐明一些Sanger测序未发现的结果？

SJ：一些嵌合变异被Sanger错过，是因为它们低于检测水平。一名患者经历了全外显子组测序，但变异同样被错过，因为测序覆盖度非常低。TruSeq Custom Amplicon实现了深度测序，让指定的基因组区域至少达到200-500倍，且针对与脑畸形有关的基因。

Q：靶向应用是否用于其他的神经发育疾病？

SJ：Walsh实验室及其他实验室已经利用靶向测序来检测其他神经发育疾病中的体细胞变异，如自闭症。

Q：其他实验室是否利用NGS来检测不同神经疾病中的体细胞突变？

SJ：最近有一项研究，是利用全基因组测序来检测导致严重智力障碍的变异。还有一些文章也显示了利用NGS来检测癫痫中的体细胞突变。

深入了解本文提及的Illumina测序系统，并索取详细技术资料

Q：如此看来，您的研究为那些研究体细胞突变在这些疾病中的作用的人们打开了一扇新的大门？

SJ：我们明确地显示，在检测体细胞突变上，NGS是比Sanger测序更好的选择。我们在8名个体中发现了体细胞突变，值得注意的是，几乎三分之二的突变都被传统的Sanger测序错过。一名个体继续进行全外显子组测序去寻找答案。不过真相是，必须开展深度测序，才能找到体细胞突变。

我必须强调，我们并不是第一个利用NGS来检测体细胞突变的。现在已经有了个案报告，其中研究人员开展全外显子组测序，并找到体细胞突变。不过，我们开发出第一种鉴定体细胞突变的高通量系统方法。现在，一些临床实验室也开始利用深度靶向测序来寻找体细胞突变。

Q：您为什么选择MiSeq系统？

SJ：这主要涉及到MiSeq和HiSeq®系统，而HiSeq 2000系统的周转时间为14天。我想通过我的设计快速了解是否有问题，因此我选择了MiSeq系统，因为它能在40小时内给我答案。我将文库上样到系统中，第二天获得结果。

考虑到HiSeq 4000系统的周转时间为1-3天，它带来了一个更高产量的选择。它让研究人员能够运行更多的样品。

Q：MiSeq Reporter软件对您的研究有何帮助？

SJ：在我刚开始用NGS时，我知道Illumina带来了很棒的测序技术，生成了很棒的集合，但我对生物信息学能力不是很乐观。在我使用MiSeq Reporter后，我的看法变了。我曾利用不同的算法和管道开展我自己的生物信息学，但是没有得到我想要的答案。我决定试试MiSeq Reporter，发现这是一个很快的过程，我最终获得了成功。

从DNA到报告的解决方案的确很有用。如果你使用一个测序集合，在测序仪上运行它，这只是第一步。生物信息学很重要，但它也具有挑战性。使用MiSeq Reporter的诀窍在于它开展目标区域的局部比对。我尝试自己比对FASTQ文件，但我是与整个基因组比对。对于大基因，比如编码细丝蛋白A的FLNA，我只获得50%的比对，因为许多序列定位不正确，被丢弃了。当我使用MiSeq Reporter软件分析相同的数据时，我的比对从50%提高到90%。MiSeq Reporter让我检测到其他方式无法检测的突变，不是因为数据不好，而是我没有用适当的比对工具。

Q：既然您又回到了新加坡KK妇女儿童医院（KKH），您目前的研究是否使用Illumina的NGS系统？

SJ：在回到新加坡之后，我成为KKH无法诊断的疾病项目的临床主管。我们正在使用HiSeq 4000系统来开展这些对象的全外显子组测序。对于综合征个体，我们正在MiSeq系统上使用TruSight® Inherited Disease Sequencing Panel，作为鉴定已知基因中的突变的第一道程序。如果是阴性的，我们接着进行全外显子组或全基因组测序，后者是在HiSeq X® Ten系统上开展的。

Q：在您回国之前KKH是否有Illumina的系统，或者说您是否影响了他们的采购？

SJ：我们并没有任何HiSeq系统，是使用我们合作者的仪器。不过，我鼓励我们的研究实验室购买MiSeq系统，因为我之前对它的印象良好。

Q：您能介绍一下Global Gene公司吗？

SJ：在波士顿的时候，我与哈佛的一名同事，Jonathan Picker博士，共同创立了Global Gene公司（GGC）。我们的目标是利用基因组学了解未充分探索的群体，并为亚洲市场（如印度、中国和中东）提供经济有效的基因组学方案，以打破传统的医疗保健，并为这些经济体带来精准医疗。

Q：Global Gene公司正在解决哪些难题？

SJ：为了从精准医疗和基因组学的进步中受益，人们需要将基因组学数据与临床背景相关联，然后建立让终端患者受益的应用。美国和欧洲在精准医疗的领域有许多专家，但南亚、东南亚和中东落后于世界其他地区。其结果是，科学文献中超过60%的数据来自全球不到1%的群体。例如，印度有13亿人，但公开的全基因组序列不足100个。尽管千人基因组计划（1KGP）有一些印度代表，但他们来自印度的特定亚群，包括Gujarati、Punjabi和Sikhs，他们只有4或5个不同的亚组。研究已经证明，印度人不同于欧洲人和高加索人，但是根据主成分分析，来自不同地区的印度个体往往离散。

Global Gene公司以及我们的合作者正在为亚洲的精准医疗打下基础，这将从印度开始，然后通过定制应用将基因组学融入这些市场的生活。

Q：这是一项开创性的工作；您将如何实现它？

SJ：Global Gene公司将利用基因组学，以积极的方式影响每个人的生活。这意味着针对特定群体创建相关和定制的应用，以解决疾病的情感和经济成本。

例如，印度每年大约有100万新的癌症患者，而2015年预计有70万例死亡。对于某些类型的癌症，如乳腺癌和卵巢癌，每年检测到15万新病例。印度的5年存活率是52%，而美国是89%，并且研究证明了肿瘤药物的效果差。我们正与英国的伙伴合作，在印度启动个性化的化疗 – 这将综合表型-基因型和药物相互作用的信息，来鉴定对每个人最有效的治疗计划。通过我们在这些群体上的知识以及获取的基因组学见解，我们也支持制药公司针对目标群体开发更好、创新且个性化的药物。

Q：为什么经济性是一个主要的关注领域？

SJ：我在印度长大，我很熟悉以经济实惠的方式提供产品的挑战和机遇。在Global Gene公司关注的市场，尽管有相当数量的患者可负担任何价格点，但经济性的金字塔意味着治疗的经济性越高，受益于这项激动人心的技术的人群数量也越大。因此，我们理念中的一个主要问题是，我们如何解决供应链，让它经济实惠？最终，我们的目标是在科学应用中创新，以建立个性化的产品，并在成本结构的效率上创新，让尽可能多的人受益。

Q：在您当医生的这段时间内，NGS对医学有何意义？

SJ：NGS改变了我行医的方式。它帮助我向那些父母解释，他们的孩子有一系列问题，是因为一种遗传病，同时我能够鉴定突变，并给他们一个更准确的答案。更重要的是，我能告诉他们是否需要担心未来的复发风险。即使有担心的理由，我们也有办法在怀孕过程中指导他们，因为我们知道那个突变。在NGS之前，我们做不到这一点。有一个词叫“生育停止（reproductive stoppage）”，就是说家庭在有了一个患病孩子后决定不再要孩子。如果这是一种未找到分子病因的遗传病，则这种情况增加。了解分子诊断改变了这一切，因为现在我能够告诉那些父母，我们可以帮助他们。

Q：您如何看待使用NGS的未来？NGS在未来将如何影响医学？

SJ：我认为，当我们回望过去，这个世纪的最大成就将是窥探“人体”的内部，并了解我们如何工作。我相信，基因组学是我们一生中颠覆性的“技术”，让我们有权利窥探内部，并将拼图的各个部分拼在一起。

过去，临床遗传学是关于潜在综合征的鉴定，并以预期的方式管理并发症。有了NGS，我们能够更加深入去鉴定致病突变，在未来甚至纠正他们，让人们过着更加健康的生活。

我认为CRISPR等工具及其他相关的基因组编辑技术将有着更高的价值和实用性。地中海贫血是东南亚地区一种常见的遗传病，3%的人携带了球蛋白基因的突变。我认为，在不远的将来，我们将利用基因组编辑工具来编辑基因组，并真正治愈这种单基因疾病。显然，这将在未来实现，而CRISPR仍在发展。如果研究人员能够优化CRISPR或其他的一些基因组编辑技术，它有望改变医学。这是NGS从根本上改变临床遗传学实践的方式，这也是激励我的地方。

Q：您下一步打算做什么？

SJ：对于Global Gene公司，我们的计划是看看我们如何建立这些基因组队列，并鉴定药物开发的潜在新通路、新靶点，以及疗法。从长远来看，我们致力于在个体水平实现个性化医疗，而不是像现在这样，一个方案用于所有人。我们希望，我们能够为每个人定制方案。

Q：帮助许多人而不是一个人，您感觉如何？

SJ：当我作为一名医生在帮助患者时，我常常在想，当一名科学家能够做什么。然而，科学让我在一个更大的范围，甚至是全球范围，帮助人们。一些功劳要属于Illumina，它制造出NGS系统，让我们可以轻松开展这一类型的研究。当你得到结果时，科学总是充满欢乐，而当你让患者发生积极的改变时，它又令人更加满足。

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