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两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(一)

近期以Illumina技术为特色的基因编辑研究文献综述

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年1月12日 来源:生物通

摘要:

  这份来自Illumina的《基因编辑研究综述》回顾了近期发表的一些文献,它们证明了Illumina测序技术在基因编辑研究中的应用。CRISPR和NGS,两大热门技术的碰撞究竟产生了什么火花?

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规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas技术是一种革命性的基因编辑方法,它利用可编程的RNA来指导核酸酶寻找基因组中的特定目标位置。这种简单的方法取代了之前那些繁琐又昂贵的DNA编辑技术,如基于蛋白质的锌指核酸酶(ZFN)或转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)。

自从最初几篇介绍CRISPR-Cas技术在原核和真核细胞中的基因组编辑应用的文献发表以来,这种技术在全球实验室的应用呈指数级增长。 潜在的应用领域包括基础研究、治疗、农业和环境研究。

2016年,也就是基因编辑首次引入人体试验两年后,美国国立卫生研究院(NIH)首次批准了CRISPR-Cas9技术在人体试验中的应用。这项决策有望通过细胞替换,在未来实现罕见遗传病、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和恶性血液病的治疗。

CRISPR-Cas9系统来源于原核生物的适应性免疫系统,它靶定并切割噬菌体或质粒的入侵遗传元件。任何DNA编辑工具的效果和安全性都高度取决于特异性。一些研究发现,CRISPR-Cas9的使用可能导致意外的脱靶效应。基于这个原因,一些研究小组正在开发检测和降低脱靶效应的方法。

CRISPR位点以及CRISPR-Cas9技术的机制

细胞和古细菌在适应性免疫中使用CRISPR-Cas9系统。CRISPR位点由短回文重复序列组成,它们被称为“间隔序列”的非重复短序列隔开。间隔序列来源于入侵的DNA,如噬菌体,在感染发生时它们复制并掺入CRISPR位点。在这个位点附近,另一个位点则包含一套编码CRISPR相关的内切核酸酶(Cas)的基因,这种酶在基因组中引入切口。

当相同的入侵DNA重复感染时,RNA分子(CRISPR RNA或crRNA)将与Cas和反式激活crRNA(tracrRNA)形成复合物,指导核酸酶抵达外源序列所在之处。Cas-RNA复合物将识别与crRNA互补并与特定的三核苷酸位点(前间区序列邻近基序或PAM)相邻的DNA目标。然后,复合物将切割和失活入侵的DNA(图1)。

图1. CRISPR位点由短回文重复序列组成,它们被称为“间隔序列”的非重复短序列隔开。间隔序列来源于入侵的DNA,如噬菌体,在感染发生时它们复制并掺入CRISPR位点。在这个位点附近,另一个位点则包含一套编码Cas内切核酸酶的基因,这种酶在基因组中引入切口。

尽管不同细菌内与CRISPR活性相关的核酸酶不同,但本综述中的大部分话题都围绕着化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes),它依赖内切核酸酶Cas9。基于这个原因,本文主要指的是CRISPR-Cas9技术。

CRISPR-Cas9系统需要两种RNA分子:crRNA(从DNA间隔序列转录而来)和tracrRNA(它与crRNA的相互作用是招募Cas9所必需的结构)(图2)。在一项里程碑研究中,这两种RNA分子杂交形成单链向导RNA(sgRNA)。这种简化的Cas9-sgRNA系统证明了基因编辑的特性。

图2. 动画显示Cas9(透明)和sgRNA(红色)与DNA(蓝色)相互作用的分子结构。

在哺乳动物细胞中,Cas9引入核酸酶诱导的双链断裂(DSB),它们可通过两种竞争性的修复机制中的一种来修复(图3)。第一种是非同源末端连接(NHEJ),它更常见但容易出错,这种修复带来插入和缺失突变(indel)。第二种是同源介导的修复(HDR),在供体DNA模板存在时,这种修复可实现精确的基因校正或插入。

图3. CRISPR-Cas9机制的示意图。Cas9搜索细胞的基因组内与20 bp的sgRNA匹配的序列。一旦发现,Cas9在匹配的序列中引入DSB。此时,两种通路将竞争性地修复引入的断裂:1) NHEJ以一种容易出错的机制修复末端,不需要同源模板,可产生小的插入和缺失。2) HDR机制需要同源序列来指导修复,可将供体模板插入序列中。

延伸阅读:

两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(二)

欢迎索取纸质版或电子版的《基因编辑研究综述》

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