两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(二)

【字体: 时间:2018年01月18日 来源:生物通

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  CRISPR-Cas9技术的成功和快速采用在某种程度上要归功于新一代测序(NGS)的普及。NGS可用来检测基因组中的目标区域,验证目标的准确修饰,并检测任何脱靶效应。基因的表达和功能随后可以通过新一代RNA测序(RNA-Seq)和染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)来追踪。

过去几年,提及“CRISPR”以及“基因编辑”的文献数量呈指数级增长,这足以证明使用CRISPR-Cas9技术的基因编辑为基因组学研究人员带来了一种强大的新工具(图4)。尽管相当一部分研究涉及到方法学本身的技术层面,但这个系统是多功能的,目前已应用在大量生物系统中。

图4.根据PubMed搜索结果,CRISPR-Cas9及相关的关键词在科学文献摘要中的出现频率不断增加。

CRISPR-Cas9系统这种在活细胞中轻松准确地插入或删除DNA序列的能力,一直是研究人员长期以来的梦想。此系统能够删除和插入遗传元件(如启动子和调控序列)和同线区域,以检测这些元件对表型或疾病的影响。

CRISPR-Cas9技术的成功和快速采用在某种程度上归功于新一代测序(NGS)的普及。NGS可用来检测基因组中的目标区域,验证目标的准确修饰,并检测任何脱靶效应。基因的表达和功能随后可通过新一代RNA测序(RNA-Seq)和染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)来追踪。这些方法也能指导CRISPR-Cas9系统的优化和其他基因编辑系统的发现。

高效、易用和多功能让CRISPR-Cas9和类似的基因编辑系统成为基因组研究中不可或缺的部分。与聚合酶链式反应(PCR)类似,这项技术有望整合到每个分子生物学实验室。

I. 科学研究

CRISPR-Cas9基因组编辑实现了快速、精确的基因组操作,可在体外或体内筛选多个突变。自从八十年代首次建立基因敲除的小鼠模型以来,转基因细胞和动物一直是分子生物学中的重要工具。如今,CRISPR-Cas9技术的出现让研究人员能够轻松且精确地突变、沉默、诱导或替换遗传元件,以研究基因功能和疾病生物学。

全基因组关联研究(GWAS)已经鉴定出与复杂性状相关联的多个基因位点,其中大部分有着较低的外显率。CRISPR-Cas9系统可用来筛选这些多态性对表型表达的影响,这要归功于其精确性和实用性。此外,它还允许研究人员平行编辑多个位点,以便对复杂的表型建模。

CRISPR-Cas9系统也为产生新的动物模型打开了大门,包括过去因操作困难而放弃的物种(比如,白色念珠菌Candida albicans因缺乏减数分裂和质粒而为传统的编辑方法带来挑战)。它还让过去无法实现的研究成为可能,比如猪器官的人源化,这些研究曾因人类免疫系统排斥以及猪基因组中包埋的逆转录病毒感染而被放弃。

应用示例:

Chen S., Sanjana N. E., Zheng K., Shalem O., Lee K., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015;160: 1246-1260.

在这项研究中,作者利用CRISPR-Cas9技术对肿瘤的生长和转移进行全基因组功能缺失筛选。利用带有67,405个sgRNA的基因组规模文库,他们诱变了一个非转移性的小鼠癌细胞系。一旦诱变,在移植到免疫缺陷的小鼠后,突变的细胞池迅速生成转移瘤。富集在肺转移和晚期原发性肿瘤中的sgRNA靶向一小组基因,这表明肿瘤生长和转移是受一组特定的功能缺失突变调控的。之后,研究人员通过单个sgRNA或一小组sgRNA来靶定初次筛选时鉴定出的高分基因,发现这明显加速了转移瘤的形成。这项研究证明了基于Cas9的系统筛选在研究体内的癌症进化上的作用。

Illumina的技术:MiSeq® Sequencer、HiSeq® 2000 Sequencer,和HiSeq® 2500 Sequencer

Korkmaz G., Lopes R., Ugalde A. P., Nevedomskaya E., Han R., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2016;34: 192-198.

为了鉴定非编码调控元件,作者将CRISPR-Cas9基因编辑应用在细胞系上,以编辑p53和ERα增强子区域的转录因子结合位点。他们鉴定出一些功能上的增强子元件,并确定了其中两个元件在调控基因表达上的作用。他们还证明,CRISPR-Cas9 tiling筛选能够定位增强子元件中的功能域。这项工作证明了体外CRISPR-Cas9编辑在研究基因组非编码区域中的作用。

Illumina的技术:TruSeq® Small RNA Kit、TruSeq RNA Library Prep Kit、HiSeq 2500 Sequencer

延伸阅读:

两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(一)

欢迎索取纸质版或电子版的《基因编辑研究综述》

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