两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(四)

【字体: 时间:2018年02月12日 来源:生物通

编辑推荐:

  CRISPR-Cas9基因组编辑的工作流程相对简单。科学家能够在1-2周内实现修饰,并在2-3周内获得修饰后的克隆细胞系。本章节将简要介绍基因组编辑实验的步骤,检查其效率和特异性的现有工具,以及测序的应用。

CRISPR-Cas9基因组编辑的工作流程相对简单。科学家能够在1-2周内实现修饰,并在2-3周内获得修饰后的克隆细胞系。本章节将简要介绍基因组编辑实验的步骤,检查其效率和特异性的现有工具,以及测序的应用。

操作过程概览

简单地说,操作过程分成以下几步:

1. sgRNA的目标选择以及试剂的设计
2. 试剂的构建
3. sgRNA和Cas酶导入目标细胞
4. 修复模板的设计(这是一个可选步骤,它利用HDR通路而不是NHEJ,带来更精确的编辑。若需要在指定位置插入特定编辑,必须采用这一步。)
5. 修饰后的细胞系的克隆分离和扩增
6. 功能检测和验证
7. 目标细胞的克隆扩增

脱靶效应

基因组编辑实验将产生混合的细胞群。一些细胞不携带预期突变,一些携带纯合突变,而另一些则携带等位基因频率不同的杂合突变。此外,细胞本身倾向于不太精确的NHEJ通路,而不是HDR,因此大多数编辑后的细胞将包含小的插入缺失。基于这个原因,编辑实验后的第一步是检测预期突变存在的细胞并分离它们,在编辑允许扩增时,扩增这个克隆。在核苷酸水平评估编辑的方法因编辑和细胞系而异,不过常用的方法如表2所示。

错配切割分析利用对错配敏感的核酸酶来检测单个错配和插入缺失。简单地说,首先利用PCR来扩增突变和对照野生型细胞中感兴趣的区域。初步扩增之后,将感兴趣的DNA变性并重新退火,形成突变位点上含有错配的异源双链核酸分子。这些错配随后被对错配敏感的核酸酶识别并消化。SURVEYOR™分析就是采用这种方法。尽管简单又经济,但这种方法对频率低于5%的突变不敏感,通量低,并且不能提供序列数据。

PCR扩增结合限制性片段长度多态性(RFLP)分析对分析HDR插入十分有用,而利用针对缺失区域两侧的引物来开展PCR分析能够快速检测缺失。这些方法都很经济,流程简单,但它们通量不高,也不能提供序列数据。Sanger测序提供了准确的序列数据,适用于任何类型的编辑;但它很昂贵,流程冗长,通量也不高。

NGS能够以定性和定量的方式评估所有这些编辑。在样本数量大,且需要验证在靶(on-target)和脱靶(off-target)效应时,这种方法特别有用。

表2. 检查编辑效率的现有方法

延伸阅读:

两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(三)

欢迎索取纸质版或电子版的《基因编辑研究综述》

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号