两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(五)

【字体: 时间:2018年02月14日 来源:生物通

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  CRISPR-Cas9基因组编辑的工作流程相对简单。科学家能够在1-2周内实现修饰,并在2-3周内获得修饰后的克隆细胞系。本章节将简要介绍基因组编辑实验的步骤,检查其效率和特异性的现有工具,以及测序的应用。

在靶效率(on-target efficacy)是评估sgRNA修饰预期基因靶点的效果的一项指标,而脱靶效应(off-target effects)是对遗传元件和整体细胞应答的意外扰动。

总的来说,基因编辑方法的特异性定义为在不需要时避免修饰的能力。它与脱靶效应的数量成反比。

脱靶效应取决于下列因素:

位置——向导序列的3’端比5’端更无法容忍错配。
数量——细胞存在无法忍受的最大数量的脱靶效应,具体取决于细胞和编辑。
向导序列——某些向导更无法容忍错配。
脱靶切割——它对试剂的比例敏感。
核酸酶——某些核酸酶更加特异。

CRISPR-Cas9基因组编辑的常规使用需要成功检测和降低脱靶效应。

评估特异性的最佳实践

人们已采用一些方法来预测和评估向导RNA的特异性和脱靶效应(表3)。

最广泛采用的脱靶效应检测方法是使用预测这些位点可能存在于何处的计算方法,再结合错配切割分析或靶向测序。生物信息学方法可能利用序列相似性分析或基于其他参数的评分系统来预测潜在的脱靶切割位点。目前公开可用的程序如表3所示。

表3. 预测脱靶效应的公开可用软件

靶向方法还包括根据部分简并寡核苷酸的环化反应,对部分随机的目标位点文库进行体外拷问,随后开展滚环扩增,SpCas9的体外切割,接头连接,以及高通量测序。这种方法的优点在于能够检查许多组目标位点相似的测序文库。缺点在于许多随机的目标位点可能不存在于感兴趣的基因组中。机器学习算法的使用在部分程度上突破了这种限制。

靶向方法会因必要的预先假设而产生偏向。发现那些可能被预测算法忽视的脱靶切割位点则需要全基因组的方法。这些方法通常分为细胞方法和体外方法。

CRISPR-Cas9技术在研究流程中的整合

CRISPR-Cas9基因组编辑技术如今让科学家能够快速方便地开展精确的基因组操作,以便在体外和体内筛选多个突变。研究人员随后可利用大量的测序方法来确定编辑过的序列对基因结构和功能的影响。例如,ChIP-Seq可确定突变对DNA-蛋白结合的影响。若蛋白质是转录因子,则研究人员可研究对表达(RNA-Seq)、RNA结构(RNA结构的化学诱导测序/CIRS-Seq)、蛋白结合(RNA免疫沉淀测序/RIP-Seq;交联免疫沉淀测序/CLIP-Seq),以及修饰或剪接(RNA介导的寡核苷酸退火、选择和连接及测序/RASL-Seq)的影响。

或者,研究人员可以系统地编辑蛋白编码区域,以便确定所编码的蛋白质的结构和功能。例如,如果蛋白质是一个甲基化因子,则甲基化变化的下游影响可以通过全基因组亚硫酸氢盐测序(BS-Seq)来直接测定。此外,科学家还可以研究它对蛋白质结合(ChIP-Seq)或染色质构象(Hi-C)的影响。这种快速精确地改变基因组以及精心测定其对基因及最终细胞功能的影响的能力,将深刻改变基因组的研究方式。

延伸阅读

两大热门技术的碰撞:CRISPR + NGS(四)

欢迎索取纸质版或电子版的《基因编辑研究综述》

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