一节课学会带肿瘤免疫抑制热点的国自然课题设计

疫情期间，工作生活有种种不便，但是也抵挡不了广大科研工作者对科研的热情，正好也是趁着这个时间多学习多交流，毕竟国自然还有一个月就要交标书了。。。写好标书的老师要在这一个月再仔细修改，找专家帮忙评估，还没写好标书的老师那可要抓紧啦。

心系各位老师的吉凯基因也没闲着，我们除了安排一批专业博士进行公益标书评估活动，还安排了一系列围绕国自然课题设计、前沿技术的直播讲座，场场爆满，人气过万。最近的一场是关于临床科研课题设计思路之肿瘤免疫抑制的，获得听众们的好评和高度认可，那么下面我们就来简单回顾一下这不到一小时的一节课是怎么介绍国自然课题设计的，还能搭上肿瘤免疫抑制的热点顺风车。

第一部分 临床科研课题设计思路

经过吉凯基因一帮博士们几年的积累，我们总结出一个临床科研课题的研究模式，就是：A基因通过调控B信号通路影响C疾病的D功能。这个模式对于做科研的老师来说肯定是不陌生的，这个模式下，课题的研究内容主要包括筛选具有临床相关性的A基因，A基因的功能，以及A基因的作用机制。与临床相关的A基因包括与疾病发生发展相关的基因表达异常，或者突变、或者修饰异常等，所以我们可以从基因组、基因组表观遗传、转录组、蛋白质组层面，从与临床问题相关的组织样本中筛选A基因。紧接的第二块内容要研究A基因的功能，根据临床问题选择合适的细胞模型和动物模型，进行功能研究。找到A基因，也确认A基因有功能了，下面就是要进行机制研究了，机制研究也是体现整个课题深度的部分，所以在一个课题中的占比是非常大的，所以下面就来重点介绍下机制研究思路。从机制研究的深度上来说，机制研究模式分为三大类：第一类分子相关性研究，也即A基因改变后，导致下游B机制的改变，可以是B的表达改变、修饰改变，也可以是空间定位改变。要找下游B，可以通过查文献，广撒网，找明星通路做验证，这种方式简单，但是可能需要多次尝试，而且创新性也不高。而随着对研究不断深入的需求，通过组学的技术比如测序、蛋白质组等技术方法分析A基因的下游分子，通过生信分析来解决机制的方向性问题，成为了很多高分文章采用的方法。找到改变的下游，那么A真的是通过B来行使功能嘛？为了解答这个问题，就要进行第二类机制研究，功能相关性分析，主要采用的手段就是功能回复实验。举个例子，A基因下调，细胞表现出功能改变，而且A下调使B基因表达也下调，那么把A基因下调的同时，把B基因上调，通过功能学检测功能是否被回复，若功能回复了，说明A下调的确是通过B行使细胞功能调控作用的。第三类机制研究是直接互作，直接互作包括蛋白与蛋白、蛋白与RNA、蛋白与DNA、RNA与RNA等，根据A基因本身的性质，选择合适的实验方法来进行分析验证，常用的实验方法包括co-IP，Pull down，RNA-pull down，RIP，ChIP等。

简单归纳一下一个临床科研课题的思路，如下图：

按照这样的研究模式，找到一个在相应疾病中没有报道过的A基因，按照这个模式一步一步去研究，做的深入严谨，发给10分文章也是没问题，比如下面这篇文章：The deubiquitylase OTUD3 stabilizes GRP78 and promotes lung tumorigenesis. 感兴趣的老师可以下载来看看。

不过这样的文章，内容虽然做的很细致很严谨，但是看起来总觉得平平无奇，就是因为缺少了一些热点，如果能加入一些近期的研究热点就会跟好。那么近期有什么研究热点呢，分析这几年国自然项目，m6A是这几年大热的方向，也是我们上期直播的主题，感兴趣的老师也可以看我们上一篇文章（线上直播课网红m6A RNA甲基化课题如何设计）。其次就是肿瘤免疫，也是我们接下去要介绍的方向。其他的热点方向还有外泌体、自噬、肠道菌群、干细胞等等，如果我们的研究课题能与这些热点方向联系上，那一定是会增色不少的。

那么下面我们就重点介绍下肿瘤免疫环路与肿瘤免疫治疗。

第二部分 肿瘤免疫环路与肿瘤免疫治疗

要了解肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗，那就需要先了解一下肿瘤免疫环路。在肿瘤免疫环路中，首先肿瘤细胞产生并释放肿瘤抗原，该肿瘤抗原被树突细胞捕获并加工，同时在这个过程中，死去的肿瘤细胞或者菌群会释放炎症因子，产生T细胞抗癌效应。接下来DC细胞等APC细胞将捕获的抗原加功递呈到T细胞，启动和激活效应T细胞。激活的效应T细胞运输并浸润肿瘤组织，通过T细胞受体TCR以及与MHCI，识别并结合肿瘤细胞，从而杀死靶细胞，杀死癌细胞会释放出更多的肿瘤相关抗原，使肿瘤免疫环路不断循环。几轮下来，肿瘤就被消灭了，而且有些T细胞会转化成记忆细胞，随时可以机动快速地扑灭肿瘤细胞的反复。然而，哪里有压迫哪里就有反抗。肿瘤细胞又具有基因组不稳定的特点，在免疫系统杀伤的生存压力下，有些细胞不断突变进化，逐渐具有了对抗免疫系统的能力，比如不表达新抗原，抗原无法递呈，对INF-gamma信号不敏感，表达更多免疫抑制分子PD-L1等。这时候，敏感的肿瘤细胞不断被消灭，不敏感的逐渐增多，肿瘤就不断增殖恶化。在这个肿瘤免疫循环中，针对不同环节发生的异常，目前也有一些治疗手段可以实施。比如在抗原递呈阶段，我们可以借助肿瘤疫苗促进抗原递呈，肿瘤识别阶段我们可以通过CART、TCRT，增加靶向肿瘤的激活T细胞，在肿瘤杀伤阶段，通过PD-1/PD-L1抑制剂，阻止肿瘤免疫抑制的发生。

在肿瘤免疫治疗过程中，最终都是落到效应T细胞的功能上。naiveT细胞在暴露于抗原并被其激活后，短期记忆T细胞可以增殖并分化为效应T细胞，效应记忆T细胞，和细胞毒性T细胞。随着抗原慢性暴露，效应T细胞逐渐耗竭;而且在这一过程中，炎症因子INF-γ会刺激T细胞表达PD-1，刺激肿瘤细胞以及其他免疫细胞表达PD-L1，进一步加剧免疫抑制，而且部分高表达PD-1的T细胞逐渐发展成不可逆的耗竭T细胞，因此整个免疫激活耐受平衡逐渐向免疫抑制方向倾斜。而这其中PD-1/PD-L1通路的影响非常大。根据对肿瘤免疫环路以及肿瘤免疫耐受平衡的了解，肿瘤免疫治疗其实可以归为两大类，一类就是通过增强免疫，来杀伤肿瘤，包括细胞因子刺激T细胞、CTLA4抗体促进T细胞激活，以及近年来也非常火热的CAR-T/TR-T治疗；另一类免疫治疗主要是使免疫正常化，去除肿瘤微环境中的免疫抑制，这其中目前研究的最多的免疫抑制通路就是PD-1/PD-L1了。而且PD-1/PD-L1具有广谱性，目前通过FDA批准的针对PD-1/PD-L1的药物已在多个癌种中有应用。

 

虽然PD-1/PD-L1是目前研究最多的肿瘤免疫抑制通路，但是PD-1/PD-L1抑制剂在临床上的应用仍有很多问题很多挑战，第一个问题就是如何提高响应率，PD-1/PD-L1的总体响应率在10-40%，还是比较低的；第二个就是如何延长相应时间；第三个是如何抵抗PD-1/PD-L1抑制剂耐药。要解决这些问题，需要筛选更有效的PD-1/PD-L1抑制剂优势人群的生物标志物，研究PD-1/PD-L1抑制剂使用时机以及与其他治疗方式的联合应用，这些工作需要更多的临床研究数据。当然，针对PD-1/PD-L1的通路机制研究也是少不了的，只有更深入了解了PD-1/PD-L1通路机制，才能为临床应用提供更好的理论依据。所以下面我就来看下以PD-1/PD-L1为切入点我们该怎么去做研究。

第三部分 肿瘤免疫抑制设计思路

针对PD-1/PD-L1的国自然课题以及文献数每年都在快速增加，所以我们又拉了这两年中标的国自然课题，去分析这些课题都在进行哪些研究，发现以PD-L1为研究对象的课题，我们也可以用一句话给概括出来，就是：A基因通过B机制调控PD-L1影响C疾病的免疫抑制/免疫治疗。这个模型是不是和前面第一部分介绍的A-B-C-D的研究模式非常相似，只不过在这一类课题里，功能是目前研究火热的和PD-L1相关的肿瘤免疫抑制。那么针对PD-L1的调控机制，其实小编在我们之前的一篇文章里（还在找研究热点，不如看看您做的基因是否和PD-L1相关？）也有过介绍，感兴趣的老师可以戳链接查看。在那篇文章里，我们介绍了PD-L1的而表达以及功能可以在5个层面受到调控：1、基因组层面的拷贝数突变或者表观遗传修饰；2、癌基因通路或炎症因子通路等对PD-L1的转录调控；3、miRNA等对PD-L1 mRNA水平的调控，以及翻译调控；4、翻译后调控，蛋白水平上的修饰如：乙酰化、泛素化、磷酸化、糖基化、棕榈酰化等；5、PD-L1通过可溶性蛋白形式或者外泌体包裹形式到达胞外行使功能。综上，PD-L1可以受到多方多形式的调控行使免疫抑制功能，就看我们的目的基因会是否会以及如何影响PD-L1了。下面我们就以两篇文章为例简单介绍下关于PD-L1的研究。

文献一：

2017年的一篇Nature通过CRISPR-cas9文库筛选到一个会影响PD-L1上膜的分子CMTM6。作者首先通过CAS9文库感染肿瘤细胞，通过流式筛选膜上低表达PD-L1的细胞，将筛选出的细胞进行sgRNA测序，发现CMTM6的敲除可以显著影响PD-L1的细胞膜上表达。

随后通过co-IP、膜蛋白TMT蛋白质组、蛋白失踪实验等机制研究，发现CMTM6与PD-L1互作，且与其内吞循环过程相关。这个部分研究主要就是进行了机制研究（直接互作、分子相关性、功能回复）。那么CMTM6影响PD-L1上膜，是否会影响到肿瘤免疫抑制，接着作者就用CMTM6敲除的肿瘤细胞与T细胞共培养，检测CD8+perforin+T， CD8+TNFα+T细胞比例，以及IFN γ和IL-2的分泌检测，判断CMTM6敲除的肿瘤细胞对T细胞的激活影响，同时运用免疫健全小鼠进行成瘤模型构建，验证CMTM6对肿瘤免疫抑制的影响。

文献二

这篇是2020年发表在 Gastroenterology（19.233）上的文章。

这篇文章的第一个实验是通过免疫组化实验发现MEF2D表达与组织中CD4+,CD8+T细胞比例呈负相关，与PD1+和TIM3+的CD8+T细胞（耗竭T细胞）呈正相关，表明该基因可能与肿瘤免疫相关。

而且MEF2D敲除抑制免疫健全小鼠体内的瘤体生长，但在免疫缺失小鼠体内对瘤体无显著影响。

初步发现临床相关性和和动物功能之后，作者通过RNA-seq，ChIP， luciferase实验验证MEF2D可调控PD-L1的转录。通过将PBMC与MEF2D敲除的肿瘤细胞共培养，检测CD8+TNFα+T细胞数量、IL2\IFNγ分泌，以及免疫健全小鼠进行成瘤模型构建，确认MEF2D敲除的确会促进T细胞的激活，去除肿瘤免疫抑制，但是MEF2D对肿瘤的生长并无影响。

作为一篇将近20分的文章，研究内容肯定不能这么简单，所以作者通过co-IP，ChIP/Re-ChIP等一些列实验发现p300、SIRT7介导MEF2D乙酰化调控了PD-L1的表达，找到了MEF2D的上游分子。而且通过肿瘤细胞与T细胞共培养模型以及免疫健全小鼠成瘤模型发现，SIRT7抑制了T细胞的激活，促进肿瘤免疫抑制。而MEF2D敲除可回复SIRT7敲除引起的免疫抑制作用。但同时，SIRT7敲除本身又可抑制肿瘤细胞体外增殖以及体内瘤体生成。看来SIRT7可以既调控MEF2D对PD-L1的调控，也可以影响肿瘤细胞的增殖，是一个潜在治疗靶点。所以最后，作者又将SIRT7敲除与PD-1抗体联用，在小鼠成瘤模型上验证治疗效果。

所以这样的一个研究，既与目前的研究热点相关，又与临床治疗相联系，既具有基础研究意义，又有临床研究意义，是一定能发高分的文章的。

总结一下这两篇与肿瘤免疫抑制相关的文章思路：

研究思路是类似的，找到A基因，验证A基因是否可能调控PD-L1，从而影响肿瘤免疫抑制。解下来您知道该怎么做了吧。

如果您还没有A基因，那也不用着急，吉凯基因历经3年，斥资上亿，完成近6000个肿瘤相关基因的功能学筛选，已从中找到明确的新的肿瘤关键功能基因——潜在的药靶基因若干，等您来寻宝~~

参考文献：
1、 The deubiquitylase OTUD3 stabilizes GRP78 and promotes lung tumorigenesis. NATURE COMMUNICATIONS | (2019) 10:2914
2、 Disruption of SIRT7 Increases the Efficacy of Checkpoint Inhibitor via MEF2D Regulation of PD-L1 in Hepatocellular Carcinoma Cells. Gastroenterology, 158 (3), 664-678.e24
3、 CMTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity. Nature, 549 (7670), 101-105. 2017 Sep 7
4、 Oncology Meets Immunology: The Cancer-Immunity Cycle. Immunity, 39 (1), 1-10. 2013 Jul 25