普洛麦格中文通讯 2002年第五期

摘要：

　　Promega公司提供了测定细胞、组织和裂解液细胞凋亡的许多工具。Apo-ONE^TM均质Caspase(半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶)-3/7测定系统是一种准确检测凋亡活性的方法，CellTiter-Glo^TM发光细胞活力测试系统能够快速、规模化地测定细胞活力。这篇文章主要介绍了Promega公司细胞研究系列产品，包括CellTiter 96^® 测试和CytoTox 96^® 非放射性的细胞毒性测试系统。

需要更多关于Apo-ONE^TM均质Caspase-3/7测定系统和CellTiter-Glo^TM发光细胞活力测试系统的信息，请查阅Promega Notes 81 第2页和第6页。

细胞死亡有几种形式？

　　文献中详细介绍了真核细胞死亡的几种机制（1，2）。细胞凋亡，又称为程序性细胞死亡，是由多种因素作用引起，包括遗传程序控制和受体介导激活。这些诱导因素可激活特异的分子级联反应，包括蛋白酶家族如Caspase。细胞结构和组织的变化包括细胞皱缩和染色体DNA片断化。后者是凋亡级联反应的最后一步，产生200bp整数倍大小的核DNA片断，在琼脂糖凝胶上呈梯状条带。

　　第二种类型的细胞死亡称为坏死，是一种能量依赖性的过程，以细胞膜破裂和随后的细胞内离子失衡为特点。体外坏死组织可观察到局域化炎症反应。在分子水平，激活的ATPase和DNase在促使细胞死亡中发挥重要作用。和凋亡中观察到的DNA片断化不同，坏死细胞染色体DNA产生弥散性降解。

什么是Apo-ONE^TM均质检测系统？在我的凋亡实验中如何使用这种测试方法？

　　Apo-ONE^TM均质Caspase-3/7测定系统是测量Caspase-3和Caspase-7活性的快捷系统（3，4）。该试剂盒包含两种组分：Caspase底物Z-DEVD-罗丹明110和Apo-ONE^TM均质Caspase-3/7缓冲液。将这两种组分混合为一种方便的、均质Caspase试剂，可直接加入到样品中进行检测。

　　底物肽链侧翼携带罗丹明基团（499nm激发，521nm发射）。当从底物中释放后，罗丹明110产生的荧光信号和Caspase-3/7剪切活力成正比。采用Apo-ONE^TM测试系统可直接在96孔细胞培养板或对纯化的Caspase进行测试，操作步骤详见技术手册TB295。因为该均质试剂和样品的比例是1：1，可调节体积以适应其它平板操作。

CellTiter-Glo^TM发光细胞活力测试系统的原理是什么？

　　CellTiter-Glo^TM发光细胞活力测试系统是一种方便、快捷、有效的测试系统，通过检测培养基中细胞产生的ATP总量检测细胞活力。由于死亡细胞或正在死亡细胞的ATP水平迅速减少，因而该测试方法是一种特异的检测有代谢活力细胞的方法（5，6）。将测试组分－CellTiter-Glo^TM缓冲液和CellTiter-Glo^TM底物混合成一种CellTiter-Glo^TM试剂，可直接加到有血清补充的细胞培养基中。
　　CellTiter-Glo^TM测试系统的化学原理是萤火虫的荧光素酶反应，在ATP、镁和氧存在条件下，甲虫荧光素转化为氧化性荧光素。测试时只需将试剂加到培养基中，在10分钟内即可得到数据。该种测试系统灵敏度高于其它常规的比色法细胞繁殖测试系统。并且CellTiter-Glo^TM测试的线性化范围很大（如对于Jurkat细胞，测定每孔的细胞数的线性范围为0到50，000个细胞。配制好的CellTiter-Glo^TM试剂含有ATPase抑制剂，阻止细胞裂解后ATP降解。

CellTiter-Glo^TM测试系统能够用于大量平板的检测吗？