分子遗传学发现提示了MDS患者的白血病预防策略

美国迈阿密大学医学院的科学家们发现，p300蛋白能够增加DNA的乙酰化，可能会组织骨髓增生异常综合征。这项研究被发表在Nature子刊Leukemia上，为白血病的治疗研究又添了一块基石。

　　

生物通报道：骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭，高风险向急性髓系白血病（AML）转化，大约有三分之一的MDS患者最终会发展成白血病。MDS治疗主要解决两大问题：骨髓衰竭及并发症、AML转化。就患者群体而言，MDS患者自然病程和预后的差异性很大，宜个体化治疗。

迈阿密大学米勒医学院西尔维斯特综合癌症中心主任Stephen Nimer医学博士，从事MDS研究已经整整30年了。对他来说，p300功能的新进展就意味着新的治疗方法。

下面就来介绍一下，该实验室发表在自然杂志子刊《白血病》上的这篇文章。

直到目前为止，DNA甲基化和组蛋白修饰异常促进人类恶性肿瘤的发病机理尚不清楚。

p300 蛋白和CREB结合蛋白（CBP），是两个完全不同，但却高度同源的赖氨酸乙酰转移酶，属于组蛋白乙酰转移酶 (histone acetyltransferases, HATs)家族成员。能够向包装压缩DNA组蛋白中添加乙酰基促进基因的展开。

以往的研究表明，在某些情况下p300和CBP的突变可能会促进癌症发展，暗示了我们它们的作为肿瘤抑制因子的功能。

延伸阅读：Oncogene》：诱导癌细胞自杀的新策略；PNAS：遏制癌症的新方法；**教授时玉舫：组蛋白去乙酰化酶抑制剂抗肿瘤重要机制

Nimer实验室的研究人员删除了NHD13型转基因小鼠（一个表型为人类MDS的动物模型）的p300基因，保留CBP基因。明显加快了白血病的发病。体外实验发现，p300的去除恢复了NHD13表达造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的能力，使其能够自我更新不断复制。将其扩展到体内实验，发现干细胞对称的自我复制水平增加，细胞凋亡水平下降。相反，删除CBP并没有影响。

仅缺失p300，而保留CBP，还能促进细胞因子信号，包括增强了MAPK和JAK/STAT信号通路的活化。由此可见，与CBP不同，p300在阻止MDS转化为AML上具有举足轻重的作用。

Nimer说，当我们将p300的基因敲除后，老鼠100%地迅速患上了白血病。令人惊讶的是，CBP根本就没有作用。这表明，在这种特定的情况下，p300是一种肿瘤抑制基因，为我们进一步了解MDS转化为白血病提供了一个机会。

我还发现一个有意思的现象，MDS细胞并不在培养皿中生长，但是当我们消除p300后发现，细胞突然继续增长了。

尽管我们发现p300对MDS的白血病转化十分关键，但是它对健康干细胞却没有明显的影响。Nimer和他的同事认为，导致MDS的基因突变一定从某种程度上影响了细胞对p300的依赖程度。现在，p300已被确立为肿瘤抑制因子，研究小组将开始研究它控制MDS细胞的信号途径。最终，他们的发现可能帮助MDS患者进行白血病的预防。

Nimer说，至今为止，除了化疗，没有任何办法能够防止MDS发展成为白血病。因此科研工作者们正在开发药物，促进p300的功能来控制MDS患者的白血病发展。

原文标题：Loss of p300 accelerates MDS-associated leukemogenesis

（生物通：欧阳沐）

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单细胞表观遗传学研究中的一些关键技术。

这些技术可以帮助我们在单个细胞中检测DNA、组蛋白和染色质水平上的表观遗传学修饰。

1.分离单细胞

在进行单细胞表观遗传学分析之前，你需要先确定自己拿到了正确的细胞或细胞类型。

如果你想要的细胞已经处于悬浮状态（比如循环肿瘤细胞），而且含量相对比较丰富，那么流式细胞分析将是你的理想选择。如果你的样本是实体组织，那么可以用酶分解掉胶原和其他细胞外蛋白。不过酶学消化对细胞影响较大，甚至可能改变基因转录情况，Voet提醒道。在把组织细胞制成悬液之后，我们就可以通过特异性的荧光标签分离出自己想要的细胞。进一步深入单细胞是比较棘手的一步，可能需要用到微流体设备，尤其是在细胞量较少的时候。

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将细胞分散到悬液中，会失去它们在组织里的位置信息。如果你想要了解单个细胞的邻居和环境线索，你就需要使用激光捕获显微切割技术。这种技术可以通过扫描组织切片，定位你想要研究的细胞，并将其提取出来。操作者需要非常小心，不要切到目的细胞流失含有RNA的细胞质，或者切掉部分细胞核，Voet指出。

数量最为稀少的细胞只能用毛细管等器具手动获取。分离到细胞之后，我们就可以进行表观遗传学分析了。现有技术一次只能进行一种类型的单细胞表观遗传学分析，你需要决定自己研究的是DNA、组蛋白还是染色质水平上的标签。

2.甲基化标签

DNA的胞嘧啶甲基化是一种经典的表观遗传学标签，这种标签通常意味着被沉默的基因组区域。之前人们一直在用重亚硫酸盐测序来进行甲基化分析，这是一种相当严酷的化学方法，主要是把所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。经过PCR富集，这些改变用二代测序很容易检测出来。近来，一些研究团队将这一技术发展到了单细胞水平。

Babraham研究所的Gavin Kelsey和Wolf Reik等人，开发了能分析单细胞中所有DNA甲基化的方法。为此，他们需要克服重亚硫酸盐处理造成的遗传物质损失。研究人员并没有像通常那样先片段化DNA，而是对单个细胞的裂解物进行重亚硫酸盐转化。然后他们对得到的DNA片段进行五次扩增以增加拷贝数。 “我们得到了很理想的单细胞甲基化图谱，” Kelsey说。（相关报道：Nature Methods发表单细胞重亚硫酸盐测序技术）

这个方案需要不少手动操作，但并不比常规重亚硫酸盐测序难多少。操作者们需要注意的主要问题是，每一步操作都有可能引入错误。Kelsey建议大家运行大量阴性对照，当你遇到问题的时候，就能很方便的找出问题所在。

Messerschmidt开发的检测法也是以重亚硫酸盐测序为基础的，不过检测的是特定位点的甲基化。他们通过限制性内切酶消化，来分离含有目的基因的片段，去除其他无关DNA。这是因为，重亚硫酸盐测序可能降解你想要分析的DNA，而这种方法能够避开这个问题生成更准确的结果，但是一次只能分析少数几个基因。“从某种意义上看，这其实比较像是一种诊断分析，”Messerschmidt说。Messerschmidt的方法可以更快得到结果，可以用来进行IVF胚胎筛选。当然，这一方案也可以用于其他数量稀少的细胞，比如小肠隐窝中的成体干细胞。

在使用这一方法时，裂解细胞需要非常小心，确保“不要都弄到管壁上”，Messerschmidt提醒道。“否则，液体快速蒸发之后你的DNA就粘在那里没用了。我们应当尽量保证DNA的良好状态，避免破坏DNA链。因为如果断裂发生在你想要研究的位置上，就会被解读成未甲基化的胞嘧啶而产生错误的结果。”Messerschmidt等人最近会在Nature Protocols上发表一篇文章，详细阐述这个方案的细节之处。

日本九州大学的Hiroyuki Sasaki及其同事开发了直接成像甲基化标签的技术，甲基化特异性原位杂交（MeFISH）。MeFISH用荧光探针结合甲基化的胞嘧啶，很容易就能在显微镜下看到这些标签，能从几百个细胞快速得到分析数据。虽然这个技术一次只能检测少量细胞，但它能够区分5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。上文提到的重亚硫酸盐测序法都不能区分这两种表观遗传学修饰。

3.染色质水平的改变

高等生物的细胞核负责储存基因组DNA，这些DNA环绕着由四种组蛋白组成的八聚体，形成碟状的核小体结构。基因组DNA以这样的形式包装成为染色质，使DNA受到良好的保护。

所有控制基因转录的调控蛋白，都要结合在DNA上起作用。而染色质的3D结构会随着细胞生活周期而变化，调节调控因子所能接触到的基因。生
人们一般使用染色质构象捕获技术，在细胞群体中研究染色质水平上的改变。但这种技术只能给出平均的3D结构，“你无法了解单细胞的染色质结构，”剑桥大学的Ernest Laue教授说。Laue教授之前参与的一项研究就解决了这个问题，找到了在单细胞中对染色质弯曲和折叠进行定量的方法。这个方法主要是Babraham 研究所的Takashi Nagano开发的，他成功将传统Hi-C的基础步骤应用到了单细胞中。研究人员在单个细胞的细胞核中交联染色质以保持环的形态，用酶消化掉非交联的染色质，然后连接自由末端并进行测序，在进行这样的微量操作，需要我们在细节处理上一丝不苟。据Laue介绍，目前只有Nagano总能获得一致性的实验结果。此外，测序后的计算分析也是这个方法的关键所在，因为DNA扩增会带来许多噪音信号。

4.揭露组蛋白上的修饰

细胞中的表观遗传学改变也发生在组蛋白水平上，比如甲基化、乙酰化和磷酸化。现在人们已经找到了在单细胞中成像组蛋白修饰的方法。美国弗吉尼亚大学的Delphine Gomez和Gary Owens合作，通过荧光探针和原位杂交分析了平滑肌细胞里的组蛋白修饰。他们对邻位连接检测进行了改良，利用二抗点亮存在表观遗传学修饰的组蛋白。虽然这一方法只能用于固定了的组织，但在不同发育阶段对细胞进行检测，可以揭示随着时间推移而发生的改变。

如果你需要检测活组织中的组蛋白表观遗传学修饰，你可以参考Kazuki Sasaki等人开发的检测技术。这个RIKEN团队在荧光共振能量转移FRET的基础上构建了新型感应器，以监控特定组蛋白残基上的乙酰化。他们开发的探针称为Histac，主要适用两种荧光蛋白夹着一个组蛋白和一个能识别组蛋白乙酰化的溴区结构域(Bromodomain)。当乙酰化不存在时，Histac感应器会生成很强的荧光信号。当组蛋白被乙酰化的时候，构象改变会拉开两个FRET元件的距离，生成较弱的荧光信号。研究人员用这个技术观察了有丝分裂过程中的组蛋白乙酰化改变。（原文连接：PNAS, 106:16257-62, 2009）不过Sasaki等人提醒道，目前这种探针需要向细胞中引入外源组蛋白，有改变细胞基因表达的可能。未来的新一代的Histac探针将会避免这一问题。