His-Tag蛋白纯化小妙招(文末有彩蛋)

【字体: 时间:2022年04月13日 来源:基因有限公司

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  如果您在使用镍柱纯化His-Tag重组蛋白过程中遇到了困扰,或许以下内容可以为您提供一些解决问题的思路。

金属离子螯合层析因其快速方便的纯化效果,迅速成为了His-Tag重组蛋白的主流纯化手段。如果您在使用镍柱纯化His-Tag重组蛋白过程中遇到了困扰,或许以下内容可以为您提供一些解决问题的思路。

  • 金属离子只能用镍?

Ni-NTA是最常用的IMAC树脂,因为 Ni2+被认为对His-Tag蛋白具有最强的亲和力。但如果对目标蛋白的产量有比较高的要求,那么尝试另一种金属离子进行优化就非常的有必要。在某些情况下,其他金属离子如 Co2+、Cu2+、Fe2+和Zn2+ 可能被证明更合适。当然,金属离子只是影响His-Tag蛋白与IMAC树脂填料结合的影响因素之一,其它的影响因素还有蛋白质的结构和特性,结合缓冲液的pH和组成等。

尤其在真核表达系统,例如纯化酵母和哺乳动物细胞表达的His-Tag蛋白时,筛选优化的金属离子或者配基是非常必要的。因为这些表达系统与原核表达系统相比,宿主细胞杂质更复杂。

  • 蛋白表达量低怎么办?

如果可以优化表达系统来提高产量,那当然是最好的,但有时候您是否发现自己不得不面对目标蛋白表达产量非常低的问题?将大量细胞培养基上样到层析柱上可能很困难,尤其是当细胞培养的体积远大于层析柱的体积时。即使您在上样前进行彻底的样品预处理,大量杂质也会进入层析柱,有两件事可以帮助改善这种情况。

首先,更换为在大多数情况下会产生更高洗脱纯度的Co-NTA,尝试例如 Bio-Works WorkBeads 40 Co-NTA。其次,优化样品和起始/洗涤缓冲液中咪唑的浓度。通常建议使用10 mM咪唑,但在不损失结合能力的情况下可以使用的浓度越高,目标蛋白的纯度就越高。

  • 镍柱上样过程中变成黄色/褐色是怎么回事?

您是否经历过用于纯化 His-Tag蛋白的镍层析柱失去蓝色,变得有点黄色或者褐色,无法再结合您的蛋白质?再多的洗涤也不会使它恢复正常功能。那么检查一下您的样本或者缓冲液中是否含有DTT和/或 EDTA?这将导致目的蛋白与树脂的结合出现问题,因为这些添加剂会从树脂中剥离Ni2+。从而使得镍柱从外观上有明显的颜色变化。在这种情况下,请使用可耐受DTT和EDTA树脂,例如 WorkBeads NiMAC。WorkBeads NiMAC 树脂上的镍附着力非常强,可以满足从含有高达 20 mM DTT 和 20 mM EDTA的样本中纯化大量带His-Tag蛋白,而不必担心镍离子脱落。因此,这种情况下的解决方案相当简单,只需切换到 WorkBeads NiMAC!

WorkBeads™ NiMAC:(详细介绍可点击此处查看

▪ 可耐受20 mM EDTA螯合剂和 20 mM DTT还原剂,免去上样前的样品预处理
▪ Ni2+离子结合牢固,脱落微乎其微
▪ 无需繁琐的再生步骤
▪ 高达40mg/ml动态结合载量
▪ 重复性高,纯度高
▪ 可预装可散装

由衷感谢购买/试用过Bio-Works层析填料及预装柱的广大用户们,如果您愿意花费宝贵的一分钟反馈您在使用Bio-Works产品过程中的一些体验,我们将不胜感激。我们希望倾听您的声音,同时也会珍视和回馈您的宝贵意见。扫描下方二维码留下您的意见和建议,我们也会根据您的选择送上回馈礼品。

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