免疫代谢组学研究技术之进步：从群体细胞分析到单细胞分析

从癌症、艾滋病到各种病原体感染，归根结底都迫切需要更深入研究免疫细胞。迅速发展的免疫代谢组学是深入了解免疫细胞的途径之一，其研究方法有哪些？

免疫细胞，尤其是T细胞，在激活和分化过程中，其代谢表型会发生显著变化——这些代谢表型的变化与免疫细胞执行的功能和其命运是相关的，研究这些代谢表型的变化有助于深入了解免疫细胞对抗病原体和癌细胞的方式。免疫代谢组学是代谢与免疫相结合的研究领域，近年来发展迅速。研究免疫细胞的代谢，首先要能够便捷及时且明确地分析不同免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞)的代谢状态。在过去的几十年里，包括流式细胞术、细胞外流量分析、质谱法、单细胞RNA测序和质谱流式细胞术等各种各样的技术被有用于免疫代谢的研究，分析对象从蛋白质到代谢物到脂质到RNA，可以从不同方向了解免疫细胞代谢。

活细胞的新陈代谢研究

研究活细胞的新陈代谢，安捷伦的Seahorse技术是便捷实用、经济的选择。Seahorse是借助荧光基团同时分析细胞周围介质中的氧气消耗率和质子释放，来测量细胞的两种主要能量途径——线粒体呼吸和糖酵解，这种方式使研究人员能够实时了解活细胞的生物能量状态，而无需添加标签。Seahorse技术允许在96孔板中对活细胞进行简便且经济的分析，可以使用内置注入口来评估某种代谢调节物对细胞的直接“即时”影响，可以很快提供结果。与Agilent XF T 细胞代谢分析试剂盒结合使用时，Seahorse提供了多参数输出，丰富的功能数据可以完全表征T细胞代谢谱。这些信息还可以作为一种常规检测方法，用于优化T细胞衍生疗法的设计和制造。（详细信息参看  Seahorse XF 分析实验流程与技术学习中心）

研究免疫细胞中的蛋白质、代谢物和脂质

质谱法用于蛋白质组学研究的优势包括其特异性和灵敏度低至单分子水平，特别是高分辨率质谱法。在过去的几年里，对整个蛋白质组的高分辨率质谱研究已经深入了解了T细胞在免疫反应过程中如何在葡萄糖和脂肪酸代谢之间转换。基于发现的定量蛋白质组学侧重于识别蛋白质，并测量多个样本集相对丰度的变化。免疫代谢研究中正在采用几种基于发现的技术，包括细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)、串联质量标签的等压标记(TMT)和无标记定量(LFQ)。代谢标记的优点是它可以以高精度确定蛋白质的变化。此外，TMT方法允许研究人员在一次运行中复用多达18个样本。

质谱法非常适合于高通量鉴定和定量代谢物和脂质。赛默飞世尔科学公司组学应用高级主管Thomas Moehring认为:“高分辨率和精确的仪器，如基于轨道阱的质谱仪，在这类应用中是理想之选。。。当与液相色谱或气相色谱等分离方法相结合时，它们可以提供一组敏感而可靠的数据，从中可以以可重复的方式识别和量化代谢物和脂质。”

单细胞分析

许多主要的免疫代谢研究都是针对批量样本的分析，但就如大厂里的员工虽然远看长得差别不大但实际各司其职、作用不同，免疫细胞特别是T细胞的丰富多样性使得研究人员对细胞群体中的单个细胞行为尤为感兴趣。单细胞分析同样可以在免疫代谢研究中大显身手。“单细胞分析可以更好地了解特定细胞类型在引入疾病或治疗时发生的情况。”

单细胞RNA测序(scRNA-seq)是当下大热的单细胞分析方法之一，可以高通量运行同时在每个细胞中检测多达5000个基因的转录组信息，虽然转录数据可能不一定是新陈代谢的直接代表，但可以提供与代谢相关的蛋白质的有用线索，甚至帮助找出导致新陈代谢变化的相关线索。10x Genomics先进的单细胞分析技术除了可以开展高分辨率的免疫细胞表征，其实更有意思的是Chromium scFFPE-seq、空间分析（Visium FFPE）和Xenium原位分析解决方案，研究人员能够采用三重互补技术对FFPE组织块进行分析——从而了解在实际病理组织中免疫细胞的代谢相关基因转录组线索与所在空间位置之间的关系，更深入理解免疫细胞在不同的位置下代谢与功能之间的关系。（更详细信息参看  单细胞、空间和原位工具在癌症免疫治疗研究中的应用  及 当单细胞遇上空间技术：新的肺部免疫生态位为抗体提供了长期的藏身之处 ）

单细胞蛋白质的高通量分析仍处于起步阶段。高通量单细胞分离技术的发展使得高通量单细胞蛋白质组学/单细胞质谱逐渐可行。例如cellenONE的proteoCHIP LF 48就是为单细胞质谱分析而开发的自动化完整解决方案，能够借助显微镜图像以无标签的方式实现选择和分离感兴趣的单个细胞样品制备，分离后的细胞可直接连接到 LC-MS/MS系统的自动进样器中进行后继的单细胞质谱分析（详细信息参看2022年度产品评选之 Cellenion新品释放单细胞蛋白质组学的潜力）。

更强大的是质谱流式细胞术（质谱流式），一种高通量单细胞蛋白质分析技术。它利用稀有金属标签抗体标记细胞表面和内部的蛋白标志物，通过飞行时间(TOF)质谱仪和检测器进行单细胞分析。由于采用稳定的金属标签和质谱检测系统，质谱流式各检测通道之间几乎没有重叠，背景可以忽略不计，轻松实现单个细胞超过 40 种蛋白的同时检测，系统全面地分析病理状态下各类免疫细胞在表型和功能上的变化。 近年来已在200多个临床试验中使用，取得了令人兴奋的进展。

Standard BioTools™蛋白质组学产品营销总监Marla Lubinsky表示::“考虑到质量细胞术不像荧光流式细胞术那样受到自身荧光或光谱重叠的影响，它可以获得更可靠的高参数免疫分析见解。” 研究人员可以使用Maxpar®Direct™免疫分析分析™轻松地将免疫分析添加到他们的研究中，这是一种经过验证的30个标记的免疫分析分析，分析时间仅为5分钟。“这种全面可靠的免疫分析方法缩短了获得结果的时间，降低了大型研究的成本。”（详细信息参看   及 Helios质谱流式细胞仪 以及  揭示肿瘤免疫的分子特征和功能 ）

组合不同技术，建立最佳方法
“这些不同的技术提供了不同的见解，因此它们相辅相成，提供了一个更完整的故事。所以，它们都是重要的途径。” 根据研究的需要选择适合的技术组合，必将为免疫代谢研究带来新的突破。