In-Cell Western 如此简单！——一种无需裂解细胞、制胶、电泳、转膜的高通量Western Blot方法

In-Cell Western（ICW）是由美国LI-COR公司开发的一种直接在微孔板内进行的定量免疫荧光（IF）测定方法，该方法结合了Western Blot的特异性和ELISA的可重复性和高通量等特点。In-Cell Western无需进行细胞裂解、制胶、电泳、转膜等步骤，不仅节省了时间，而且大大提高了实验通量和重复性，能更好地应用于高通量药物筛选研究。

01. In-Cell Western实验流程

实验流程

①以一定密度在96/384孔板上培养细胞；

②生长到合适密度后，加药物或其他处理；

③加入多聚甲醛进行固定；

④加入Triton X-100对细胞进行透化处理；

⑤封闭30 min；

⑥加入一抗孵育1h；

⑦加入荧光标记二抗孵育1h，洗涤，Odyssey 成像检测。

02. In-Cell Western重复性更高

用Western Blot方法分别在两张膜上检测GAPDH和PMLC20两种蛋白，每张膜各做13次重复，CV 值0.27；GAPDH和PMLC20通过In-Cell Western方法检测，做30次重复，CV值 0.08-0.16。

与传统Western Blot相比，In-Cell Western的通量更高，CV值更小，提高了实验结果的重复性和准确性

与传统Western Blot相比，In-Cell Western 更快速便捷。

03. In-Cell Western的应用

In-Cell Western的应用举例-蛋白磷酸化研究

该实验利用In-Cell Western技术检测ERK蛋白的磷酸化水平。总ERK蛋白（700 nm）作为参照蛋白，进行蛋白均一化。通过不同浓度的EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子）刺激细胞，来观察ERK蛋白磷酸化（800 nm）水平变化。

随着EGF的浓度逐渐增加，ERK蛋白磷酸化程度显著增加。加入100 ng/ml 的EGF比不加入EGF的ERK蛋白磷酸化高出16倍以上。

高通量快速的In-Cell Western已广泛应用到细胞自噬、凋亡、癌症、药物研究、信号转导、离子通道、基因表达等多个应用领域。

In-Cell Western应用文献还可登录LI-COR 官网查询：

04. In-Cell Western的优势

优势总结

①高通量，一次可实现6*96/384样品检测；

②可用不同荧光标记二抗同时检测几种蛋白；

③可做大分子量细胞蛋白检测；

④特异性高、灵敏性好，

⑤重复性好、精确度好；

⑥简单快捷，无需细胞裂解、制胶、电泳以及转膜等步骤，减少误差，提高实验效率，节约时间

丰富的应用

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