南非玉米叶片分离 Microbacterium 菌株 ARC56GC 的基因组测序与系统发育分析

《Microbiology Resource Announcements》：Genome sequence of Microbacterium sp., an endophyte isolated from Zea mays in South Africa

　　

摘要

Microbacterium 属细菌是与植物相关的放线菌，具有促进植物生长的潜力。本文报道了从南非玉米叶片中分离出的 ARC56GC 菌株的 3.42 Mb 环状基因组。比较基因组学研究表明，Microbacterium testaceum 是其最近的亲缘菌株，而平均核苷酸同一性 (ANI) 分析表明 ARC56GC 代表 M. testaceum 物种复合体内的一个基因组上独特的谱系。

公告

Microbacterium 是一种与植物相关的革兰氏阳性放线菌属，某些菌株具有促进植物生长的特性，例如增强幼苗生长和耐盐性（1，2）。作为在南非寻找潜在有益玉米内生菌的一部分，对一种与玉米相关的 Microbacterium 菌株的基因组进行了测序，以扩展基因组资源，并为未来研究其植物相关功能提供基础。

ARC56GC 菌株是从南非夸祖鲁-纳塔尔省一个商业田块（GPS 坐标：29.5500082, 30.2384825）采集的经过表面消毒的 symptomatic 玉米叶片组织中分离得到的，时间是在 2024/2025 生长季节。虽然这些叶片表现出与 Goss 黄萎病一致的症状，但本研究的主要目的是分离细菌内生菌而非调查该疾病。叶片组织经过表面灭菌后，浸泡在无菌蒸馏水中。将悬浮液涂抹在营养琼脂酵母提取物 (NBY) 培养基上，并在 25–28°C 下孵育 3–5 天（3）。通过 KOH 测试和革兰氏染色确认了一种产生黄橙色黏液菌落的纯化菌株为革兰氏阳性菌。根据制造商的建议，使用 Zymo Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit（Zymo Research, Irvine, CA）从培养物中提取 DNA。

使用 Megaruptor 3（Diagenode）对 DNA 进行机械剪切，并根据制造商的协议使用 PacBio HiFi Plex Prep 和 SMRTbell 库制备工作流程制备文库。在 PacBio Revio 平台上使用 Revio SPRQ 聚合酶试剂盒和 SMRT Cell 25M 进行测序，生成了 8,287 个 HiFi 读段，N₅₀ 为 6,496 bp（NCBI SRA SRR39659930）。使用 Flye v2.9.2（4）进行de novo组装，得到一个 3,416,393 bp 的环状基因组，鸟嘌呤 + 鸟苷（G + C）含量为 69.64%，基因组覆盖率为 14 倍（NCBI 存取号 JCASAO000000000）。在 Geneious 9.1.8（Biomatters, Ltd., Auckland, New Zealand）中旋转基因组，将 dnaA 基因定位在序列的开始位置。使用 KBase（5）中的 CheckM v1.0.18（6）进行质量评估，估计完整性为 98.99%，污染率为 0.51%，表明基因组组装质量很高。

GTDB-Tk v2.3.2（7）将 Microbacteriaceae 属的 M105（GCA_022702225；M. testaceum，分类学上尚无定论）识别为最接近的参考基因组，平均核苷酸同一性 (ANI) 为 97.91%。使用 Type (Strain) Genome Server（TYGS）（8Microbacterium testaceum NBRC 12675 被确定为最接近的类型菌株。与 M. testaceum NBRC 12675 的数字 DNA–DNA 杂交（dDDH）值分别为 76.2%（d₀）、43.0%（d₄）和 69.8%（d₆），表明存在显著的基因组相关性，但在同源区域存在差异（8, 9）。

使用 M1CR0B1AL1Z3R（10）进行的成对 ANI 分析显示出 M. testaceum 内部存在相当大的多样性（ANI < 95）。ARC56GC 与 Microbacteriaceae 属的 M105（97.77%）和 M. testaceum SORGH_AS_0426（97.38%；GCF_030818605）聚类最为紧密，这两种菌株均与美国中的谷物或草本植物宿主相关（11）。

图 1）进行的核基因组系统发育分析与 ANI 聚类结果一致，ARC56GC 始终与 M105 和 SORGH_AS_0426 归为一组（见表 S1 和 S2 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33093251 和图 S1 https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33093251）。结合 dDDH 结果，这些发现表明 ARC56GC 在 M. testaceum 物种复合体内形成了一个基因组上独特的谱系。

图 1

图 1 基于最大似然原理的系统发育树显示了 ARC56GC 菌株在 Microbacterium 属中的位置。该树是通过使用 M1CR0B1AL1Z3R 2.0 网络服务器，从分析的基因组中共享的 173 个核心基因的串联比对重建的（同源基因识别标准：≥70% 的氨基酸同一性和 ≥70% 的比对覆盖率）。定义为所有分析基因组中都存在的核心基因代表了保守的核心蛋白质组，用于推断不同分类单元之间的垂直进化关系。分支节点处的数字表示自助法支持值。对于 M. testaceum 菌株，如果有的话，还会标明其地理来源和分离的宿主或环境。

致谢

我们感谢农业研究委员会（Grain Crops）提供的基础设施。