用于生产亚病毒颗粒疫苗的弱化型人巨细胞病毒株TR-VAC的基因组特征分析

《Microbiology Resource Announcements》：Genomic characterization of the attenuated human cytomegalovirus strain TR-VAC developed for subviral particle vaccine production

　　

摘要

我们报告了减毒人类巨细胞病毒株TR-VAC的完整基因组序列，该病毒株是为生产亚病毒颗粒疫苗而开发的。Oxford Nanopore双端测序验证了所有工程改造，包括UL130修复、UL25终止密码子的引入、ddFKBP插入、GFP的删除以及细菌人工染色体骨架的保留，且未发现大规模的结构重排。

公告

人类巨细胞病毒（HCMV，属于Orthoherpesviridae科）是先天性疾病的常见原因，也是移植受者出现并发症的重要因素（1）。最近开发了一种基因减毒的HCMV株TR-VAC，作为基于亚病毒颗粒（称为Dense Bodies2）的疫苗生产所需的种子病毒。其主要特征是恢复了五聚体复合物的表达，消除了UL25的表达，并对IE1/IE2进行了条件调控。虽然TR-VAC的基因设计和功能特性已经有所描述（2），但其完整基因组序列此前尚未公开。在这里，我们提供了TR-VAC的全长基因组序列，并在核苷酸水平上确认了所有工程改造的完整性。这一资源为这种基因减毒种子病毒株建立了一个公众可访问的参考序列，为其质量控制、可重复性以及进一步的前临床或临床研究提供了基础。

TR-VAC是基于实验室毒株Towne3, 4构建的。TR-VAC的基因组在含有氯霉素的溶原体培养基中的大肠杆菌 SW102中以细菌人工染色体（BAC）形式扩增，并按照Macherey-Nagel公司的NucleoBond PC 500试剂盒的协议进行纯化。纯化的BAC DNA使用Invitrogen公司的Qubit 2.0荧光仪进行定量，其质量通过ThermoFisher公司的NanoDrop 2000分光光度计进行评估，并通过限制性内切酶PmeI进行线性化处理。

基因组DNA文库是使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）的ligation测序试剂盒V14（SQK-LSK114）按照制造商的说明制备的，并在ONT公司的PromethION24设备上使用R10.4.1流式细胞仪（FLO-PRO114M）进行测序。双链读取数据使用ONT公司的Dorado v0.3.0软件进行比对，仅将双链读段与HCMV Towne-BAC参考基因组KF493877.1进行比对（比对工具：epi2me-labs/wf-alignment v0.5.0）。通过samtools consensus v1.16.1（5）生成共识序列，并使用MUMmer4包中的nucmer工具（6）将其与HCMV Merlin参考基因组NC_006273.2进行比对，并相对于参考基因组进行线性化。

7）。使用VAPiD v1.6.7（8）确认了HCMV预期基因的存在。通过BLASTN搜索和读段映射分析（图1；表1）确认了工程插入位点处存在FKBP衍生的不稳定结构域。组装基因组的UL130序列缺少非功能性Towne UL130等位基因特有的C末端双腺嘌呤插入（9）。开放阅读框的翻译结果显示出类似Merlin的C末端氨基酸序列，而非修改后的Towne变异序列，证实了修复效果。在UL25位置，所有16个ATG密码子均被替换为TGA终止密码子。重建的病毒基因组包含了大约6 kb的来自克隆载体的BAC骨架序列。绿色荧光蛋白（GFP）的缺失通过手动检查和BLASTN搜索得到确认。综合这些序列分析结果，可以确认TR-VAC基因组中存在所有预期的工程改造。

图1

图1 TR-VAC基因组及其工程改造的示意图。所有工程改造位点均根据Merlin参考序列进行了线性化显示。每个位点都经过手动检查并验证，确保符合预期设计。基因组构型与Krauter等人的描述一致（2），并在图1中进行了说明。

表1

表1 基因组特征和序列改造 ^a

特征	起始位置	结束位置	备注
BAC骨架	197464	203815	6,351 bp的BAC序列
GFP删除	203547	203548	删除了1,550 bp
ddFKBP插入	173660	173989	插入了329 bp
UL130修复	176884	177529	C末端类似Merlin序列
UL25 ATG替换	30055	30057	ATG > TTG
UL25 ATG替换	30146	30148	ATG > TTG
UL25 ATG替换	30214	30216	ATG > TTG
UL25 ATG替换	30572	30574	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	30618	30620	ATG > GAA
UL25 ATG替换	30744	30746	ATG > GAA
UL25 ATG替换	30754	30756	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	30895	30897	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31231	31233	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31260	31262	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31312	31314	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31403	31405	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31663	31665	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31734	31736	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31870	31872	ATG > TGA（终止密码子）
UL25 ATG替换	31888	31890	ATG > TGA（终止密码子）

^a

所有列出的特征和改造均通过读段映射的手动检查、基因组比对、BLAST搜索或其组合进行确认。坐标参考的是提交的TR-VAC基因组序列，该序列已相对于HCMV Merlin参考序列（

致谢

本研究未获得任何公共、商业或非营利组织的特定资助。