续前 谁可小看“蛋白标准”（中）

谁可小看“蛋白标准”（上）

3. Western专用的蛋白分子量标准

①生物素标记蛋白标准

未染色的Marker在做Western时，需要在印迹前先用丽春红或者是SYPRO荧光蛋白染色液等不干扰Western Blot的染色方法显色，在胶上做标记最后才能“拼”在最后的结果中，如果是预染的Marker就要在转膜后标记膜，或者剪膜，最后在“拼上”。要是想直接将Marker结果显示在最后结果上，不用手工作图或者拼接，那就要Western专用的Marker了。比如生物素标记的蛋白标准。这种方法主要是配合化学发光法：在蛋白分子量上标记生物素，通过带有抗生物素的抗体或者偶联链亲霉素的抗体，在化学发光检测到目的蛋白带时就可以同时看到相应的分子量标准一起发光显影了。不同于普通蛋白分子量标准的便宜、预染蛋白分子量的方便，这一方法的优点是与Marker和目的蛋白对应性好，同时在同张片上显示，不用拼接，利于分析。缺点是如果样品中带有生物素背景，那个抗生物素抗体有可能影响结果，而且反应体系太过复杂也会干扰实验结果。

生物素标记蛋白分子量产品其实并不多的，这里要提一下的就是上海康成的蛋白质检测试剂盒。这个检测试剂盒是上海康成生物工程有限公司的拳头产品。一般而言，常见的生物素标记都有一些缺点，比如说，要另外购买和制备试剂啊，要摸索条件啊等等，而康成的这个试剂盒配合提供了所有需要的试剂，而且用于免疫印迹化学发光检测的条件也已经得到优化，不用自己去摸索了，另外此试剂盒的蛋白标准跨度较大——从10kD到200kD，这些都方便了使用者准确的估计目的蛋白的大小。至于在价钱方面，这个试剂盒650元，可以用50次（mini-blots），即一次13元，是在大部分实验室可以接受的水平。

②特殊标记蛋白标准

在经过修饰的蛋白标准中，除了生物素标记以外，近些年由于下游蛋白操作的丰富化与复杂化，也出现带有“尾巴”的蛋白标准。比如His-Tag，如果每个Marker条带都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗体很容易将Marker条带显示在Western结果上。很方便，问题就是有可能有潜在的干扰，比如样品中正好有类似Histag的结构。不过这可以通过对照检测的。

*His₆标记，1kD，可用anti-His抗体或Ni-NTA（Ni氨三乙酸配合物）conjugates检测

*HA(hemagglutinin 红血球凝集素)，大约1kD，可用anti-HA检测

*GST，26.5kD，可用anti-GST检测

*c-myc，可用anti-Myc检测

*S标记，S-protein FITC(异硫氰酸荧光素,Fluorescein isothiocynate) conjugate检测

这些经过特殊标记的蛋白Marker一般都不会影响目的蛋白的正常显色，而且和目的蛋白显色在同一张膜上，有时还可以作为阳性对照，但是各自的检测显色机制和效果又有一些区别，比如Invitrogen的BenchMark和Qiagen的6xHis Protein Ladder虽然都是用His作为标记，但是前者包含10条蛋白条带，可以用Invitrogen自产的一种染料或者考马斯亮蓝染色，也可以用anti-His的抗体进行色原显色或者化学发光进行检测，而后者强调的是精确的标定和阳性对照的作用，而且Qiagen由于只出了这一种蛋白相关标准，对统一配置的要求没有Invitrogen高，在说明书里也没有讲到要配合使用Qiagen的相关其它产品。至于价钱方面，两家都是出了名的价格高，但相对而言这里Qiagen好像要便一点。

另外值得一提的是Roche的Multi-Tag-Marker，其实不用讲，大家也知道这种蛋白标准的优势：当然是它的全面性，这个全面性不仅仅是指Multi-Tag-Marker包含GST-, HA-, c-myc-, His₆-这四种最经常使用到的标记，实验室购买后就可以用于多个标记蛋白的同时使用，而且，Multi-Tag-Marker的全面性还表现在它除了可以用在Immunoblotting，还可以用于Immunoprecipitation免疫共沉。是不是还是挺值得买的呢？（张迪）