蛋白功能研究新趋势：体外表达产品(下)[选购宝典]

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兔网织红细胞

    兔网织红细胞本来是最早的体外表达体系之一，想想红细胞是没有细胞核的，没有太多DNA、RNA的干扰，却有大量合成蛋白的能力，作为单纯的体外翻译系统自然是上佳之选。不过，由于真核细胞中转录和翻译发生在细胞的不同位置，反应条件略有差别，如果以DNA片断或者质粒为起始材料的转录翻译偶联反应，可能存在条件优化的问题，所以目前的产品通常有分步和偶联两种选择，蛋白表达量比E.coli小。相比其他来源，兔网织红细胞来源有限而且成本高，某种程度上限制了其大规模高通量的应用。虽然是真核体外表达系统，兔网织红细胞对RNA是否有帽子结构要求不太严格，能识别真核原核的核糖体结合位点，可惜由于没有细胞空间内细胞器间的协作，翻译后加工和糖基化等过程依然不能完成。不过，兔网织红细胞是最有希望取得这方面成果的体系，而且Promega在这方面也有一些有益的尝试。

Promega TNT 兔网织红细胞

   Promega的TNT兔网织红细胞体外表达系统中，Quick Coupled 翻译转录系统是单管的偶联反应，能简化实验过程和节约时间，可进行蛋氨酸标记，单管反应（50ul）1.5小时产量可达300ng，有T7，T3，SP6的不同选择，是原来的Coulped系列的速度升级版吧。不过如果需要标记其他氨基酸，原版的貌似更方便些，提供3种标记方式。Gold TNT Express96更是为高通量反应需求而设计的96孔反应体系。Promega还有一些纯粹做体外翻译的兔网织红细胞裂解物，有核酸酶处理与否的区别，还有和麦芽提取物混合的裂解物——如果用兔网织红细胞翻译不出来，一般会建议你试试其他两种，这个产品可以省掉这种麻烦。

    不过Promega的产品中比较特别的产品是一种microsomal membranes。生物通前面提到过，即使是真核体外表达系统，由于缺少一定的细胞器结构，蛋白质的翻译后加工问题一直没有得到很好的解决，不过，兔网织红细胞是其中最有希望的一个。Promega这类微粒体膜正是一种有益的尝试。据厂家数据表明，加入微粒体膜的体外翻译体系，可以检测到蛋白质翻译后加工的一些步骤，比如信号肽切除，一些核心糖基化反应。这个现象很有意思，是不是在提示我们，只要体系中有一定的某种细胞器的膜结构，就有可能进行翻译后加工？这些膜结构是否有一定的空间要求？是否要求必须是某种小囊泡结构？以后模拟体外翻译的体系是不是可以设计出带有这种结构的反应容器？在制备裂解物的时候是不是可以避免破坏或者除去这些膜结构？据说这类microsomal membranes不适合用于麦芽提取物系统，因为麦芽提取物制备时EDTA一步除去了一种信号识别颗粒(signal recognition particle, SRP)，而SPR对于蛋白质附着小囊泡膜和起始翻译后加工是必需的。那么，是不是在制备裂解物的过程中去掉了某些元件导致体外翻译后加工的失败？这些问题存在多年一直悬而未决，不过，既然是体外翻译乃至开展大规模蛋白质组研究的绊脚石，那相信迟早会被解决掉的。这个人会是你吗？谁都有机会哦。要特别说明的是，Promega这类微粒体在制备过程中小心除去了附着在内质网膜上的核糖体和mRNA污染以保证实验的稳定。 只可惜一向物美价廉的Promega，这个产品要2000左右，真是想说爱你不容易呀。

    除了这几种，生物通前文提到的荧光标记赖氨酸用于体外表达过程中的荧光标记产品，还有生物素标记产品都可以用于兔网织红细胞体外表达系统。方便各种标记反应的进行。

    Roche没有兔网织红细胞体外表达系统，也许是因为这种需要取材于兔血的成本实在太高了吧，不符合Roche的高通量大规模的实验需求。除了Promega，Ambion和Novagen也有偶联的反应体系或者单纯的体外翻译裂解物提供。表达量最高也大约在200ng-250ng范围。

　

麦芽提取物

    麦芽提取物是区别于兔网织红细胞的另外一个体外表达真核体系。麦芽来源丰富，比兔血经济，表达量也不高，一直是兔血之外的第二之选。麦芽提取物也常常用来表达哺乳动物的基因，因为植物体系中没有哺乳动物蛋白的干扰。

    一直到最近才突然受到Roche的重视而获得大力发展——原因在于，如果补充反应体系的损耗和去除副产物抑制，这个体系可延长反应时间，从而达到比较高的产量——1mg/ml.24hours。而生物通上文专门介绍过的Roche的CECF技术正好可以解决这个问题，从而使反应时间可以长达一周甚至两周时间！只可惜Roche这个体系要求Roche专用的仪器配套使用，这样成本就不小啦。麦芽提取物属于真核体外表达系统，不过对RNA的帽子结构和核糖体结合位点要求不高，质粒或者PCR产物都能应用。一般认为其对真核基因的表达应该会比E.coli 更好，得到的产物可溶性也更高。Roche的Wheat Gern分为小规模(产量50ug/50ul)的RTS100和大规模的（产量1mg/ml）的RTS500两种。如果你的模版是RNA，那麦芽体系就是最好的选择了。

    Promega也有TNT Coupled 的麦芽提取物系统，也是偶联的单管反应，比较省事，有T7、T3、SP6之选，还有非常必要的对照提供。同样可以做3种氨基酸标记。如果单纯做麦芽提取物的体外泛音，Promega也有单纯的抽提物提供。　

小结

    生物通前面介绍了体外表达的优势和市面上体外表达体系的一些特色，其实，体外表达的应用远远不止这么一点。随着高通量药物筛选、蛋白组研究的巨大需求，相信体外表达很快会有更大的发展。不过，体外表达只是研究的手段之一，并不能最终替代细胞表达。比如在细胞水平上研究基因的功能就要求细胞表达。再说，应用到真正大规模生产，细胞表达还有自己的优势，那就是借助细胞自我增殖来放大表达的规模。生物通在这里介绍这种技术并非要强调谁更好，而是希望大家能根据自己的实验需要、时间安排和经费能力选择最适合自己的方法。（完）

 

蛋白功能研究新趋势：体外表达产品(上)

体外表达(三)：应用前景

体外表达(二)：原理和技术要点

体外表达（一）：基因组学迈向蛋白质组学的桥梁