“酶”头一蹙,计上心来 Qiagen VS ABI(III)[选购宝典]

【字体: 时间:2006年05月18日 来源:生物通

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(续前) 

 ·定量PCR技术报告之三:如何选择荧光定量检测技术(I)之SYBR Green I系列

 “酶”头一蹙,计上心来 Qiagen vs.ABI(II)

 定量PCR技术报告之三:“酶”头一蹙,计上心来 Qiagen VS ABI(I) 

、ABI 的金字招牌
    说实话,这种化学修饰的、需要在95度激活的最严谨的热启动Taq酶,并非由Qiagen原创,而是PCR专利持有人之一,生命科学领域仪器供应商收入排行榜亚军——ABI(美国应用生物系统公司)最早推向市场的。话说当年Mullis发明PCR技术后,Roche以30亿美元的天价收购了Mullis所在的Cetus公司以及PCR专利,可是当时Cetus还和当时的Perkin Elmers公司合作开发PCR仪器,所以部分PCR专利依然被坚持牢牢控制在PE公司手里——直到PE收购ABI,最后不知怎的,PE其他部分又被分拆出售,ABI控制了这无价之宝的PCR专利——至今每年依然坐享估计超过5千万美元的专利使用费,即使为此要花费上千万美元的官司费用也在所不惜。言归正传,ABI对PCR技术的发展和推广作出了不可磨灭的贡献,特别是在定量PCR领域,ABI率先推出的Taqman探针法亦成为定量PCR的标准方法之一。正是因为这种霸主地位,ABI的PCR仪和PCR试剂亦成为追求品质和稳定性的用户的首选。自然而然,选择ABI的仪器就希望能够配套的使用到ABI的定量试剂。

    ABI的SYBR荧光染料定量PCR试剂盒主要包括两种:SYBR® Green PCR Core Reagents和SYBR® Green PCR Master Mix(主要区别在于前者包括AmpErase® UNG),其中SYBR Green的染料其实各个厂家都差不多——据称ABI的SYBR Green就是从Molecular Probes买来稀释的,而真正值得注意是在ABI的“金牌”酶:AmpliTaq Gold® DNA Polymerase——特别是若干年前国人的金牌情结,ABI就光凭这个名字曾经打动多少人的心,名字起的确实不错。

    AmpliTaq Gold并不只是名字起的好听,也确确实实是ABI定量PCR试剂中的一块金字招牌。正如前文提到的要解决SYBR Green的非特异性瓶颈问题,DNA热启动聚合酶是最好的选择之一,AmpliTaq Gold也许是第一个真正意义上的Hot Start——即通过对Taq酶的修饰确保在95℃才激活,根本上防止了反应前非特异性扩增。AmpliTaq Gold对Thermus aquaticus Taq DNA polymerase进行化学修饰改造(Qiagen的HotStarTaq也进行了相似的改造)——通过这种改造,修饰成份可以封闭AmpliTaq活性位点,在95℃之后,这种修饰成份也就从AmpliTaq上释放出来,还原AmpliTaq扩增活性。这样就确保了DNA在完全解链的情况下才会开始PCR扩增反应。这种利用大肠杆菌重组表达获得的分子量为94KD的重组Taq酶,高纯度(ultra-pure),无gelatin干扰,有良好的耐热性,强扩增力,以及重复性。比较于Qiagen的相对应的产品,ABI的AmpliTaq Gold所需的激活时间较短(5分钟左右,和Qiagen HotStarTaq Plus相当),扩增的片段可以达到5Kb。

    另外在ABI的SYBRGreen 试剂盒中还有一样东西是ABI特有的,那就是AmpErase UNG。定量实验对于准确性的要求是普通PCR无法比拟的,但在实际操作中PCR反应可能产生各种各样的扩增,为了防止非目的片段的扩增就必需首先确保没有污染。污染的来源主要有两种,第一种是操作过程中模板,试剂或者器皿导致的,另外一种就是扩增子交叉转移(amplicon carryover)。前者可以通过严格的实验室控制来避免,而对于后者这种内生性的污染,科学家们设计了一种有效方法,即尿苷酶(Uracil-N-Glycosylase,UNG)法,也称为尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)法,这种酶可以移除DNA中的尿嘧啶,在扩增过程中将dTTP替换为dUTP使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来——因为前面的扩增产物对UNG敏感,所有可以在PCR前对新配制的反应用UNG处理以破坏非特异扩增产物。

    ROX荧光染料对照也是ABI系的定量PCR仪所必需的,为了平衡96板中管间的差异,需要ROX作为对照进行平衡,否则难以得到正确的溶解曲线而变成波浪线。所以,你可以看到,虽然96孔板仪器设计上有固有的偏差,但是ABI总是能提供校正方法以保证实验结果的严谨的。毕竟是大腕啊。(生物通原创,谢绝转载)

 

  ·定量PCR新技术报告之二:更准确、更安全的GeneXpert定量PCR一体机
  ·定量PCR新技术报告之一:UPL
  

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