从样品制备优化你的NGS

【字体：大中小】 时间：2013年11月26日 来源：生物通

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　　第二代测序技术NGS将遗传学研究推上了新的台阶，其无与伦比的高通量，使多种应用得以实现。要完全享受这一技术带来的便利，我们就需要制备与测序平台相匹配的样品。为此人们开发了许多工具，如今，将原始DNA转化为NGS文库，已经变得越来越容易。

生物通报道：第二代测序技术NGS将遗传学研究推上了新的台阶，其无与伦比的高通量，使多种应用得以实现。要完全享受这一技术带来的便利，我们就需要制备与测序平台相匹配的样品。为此人们开发了许多工具，如今，将原始DNA转化为NGS文库，已经变得越来越容易。

文库制备试剂盒

制备NGS文库需要先提取DNA样本，利用超声或酶将其片段化，通过琼脂糖凝胶或磁珠选择合适大小的DNA片段，对DNA片段末端进行修剪，并在3’端加上与测序仪相配的接头。这些接头还可以作为“条码”，实现多重应用。如今市面上有许多NGS文库制备试剂盒，能使上述工作变得更加简便。

尽管NEB公司并不生产二代测序仪，不过该公司开发了多种NGS样品制备工具，例如可用于Illumina、Life Technologies和Roche/454测序平台的NEBNext®系列产品。

据NEB负责二代测序产品的Fiona Stewart介绍，NEBNext Ultra™ DNA（或RNA）prep试剂盒不仅适用于低量样本，还能够处理福尔马林固定、石蜡包埋的组织FFPE。“人们越来越希望测序像FFPE这样富有挑战性的样本，我们针对这些困难样本，开发了可靠的制备方案，以帮助研究者们获得高质量的文库”Stewart说。

Illumina公司为NGS样品制备提供了两种选择，TruSeq试剂盒和Nextera试剂盒。TruSeq试剂盒能够帮助人们获得高质量的数据，达到理想的覆盖度。“TruSeq试剂盒能够为人们提供准确且可重复的结果，”Illumina的市场经理Daniel Peiffer说。TruSeq试剂盒中的接头支持多重应用，试剂盒还提供了筛选DNA片段的磁珠。近来这一产品线迎来了新成员：TruSeq DNA PCR-Free试剂盒和TruSeq Nano DNA试剂盒。

TruSeq试剂盒制备文库需要五到六个小时，而Nextera试剂盒的工作流程更为快捷，能够在90分钟以内生成完整的文库。Nextera试剂盒以一种转座酶为基础，能同时完成DNA的片段化和接头的添加，这一方案也被称为“tagmentation”。如果你需要快速完成大量样本的测序，那么Nextera试剂盒就是个不错的选择。

Illumina公司也为RNA研究提供了相应的TruSeq试剂盒。在这种试剂盒的帮助下，研究者们不仅可以进行整个转录组的研究，还可以同时检测12至2,000个靶向基因的表达（TruSeq Targeted RNA试剂盒）。

增强特异性

靶向富集使人们能够在基因组（或转录组）中选择感兴趣的区域进行研究，这不仅能够增强突变检测的灵敏度，还能够提高通量。“在维持突变检测灵敏度的同时，富集技术所提供的序列覆盖度越均一，就能在一次测序程序中实现更多重的检测，”Roche的市场主管Ji Wu说。

目前靶向富集技术主要有两种方法，一种是以扩增子或PCR为基础的富集，另一种是以杂交为基础的富集，我们可以根据自己的实验类型加以抉择。

安捷伦公司的HaloPlex、Life Technologies的AmpliSeq™、和QIAGEN的GeneRead DNAseq Gene Panel，都是应用以扩增子或PCR为基础的富集技术。总的来说，这种方法更为简单快捷，更适合于快速的基因筛选。“当你知道要找的突变类型，也知道这些突变可能所处的区域时，就可以采用以扩增子为基础的富集工具。” Wu说。不过从另一方面看，这种方法也可能会有所遗漏。

以杂交为基础的靶向富集，通常用于全外显子组测序，能够高度保真的在目标区域检测突变，例如检测拷贝数突变、插入/缺失突变、易位突变和SNP。“对于某些基因组区域或序列类型，可能难以设计唯一有效的PCR引物，而以杂交为基础的富集方法对上述限制不那么敏感，” Wu说。据他介绍，Roche NimbleGen的杂交富集技术，结合了多达2.1M的探针，具有出众的灵活性，能够达到更均一的序列覆盖度和更有效的SNP检出。

除此之外，以杂交为基础的靶向富集工具还包括：安捷伦的SureSelect、Life Technologies的TargetSeq™、Illumina的TruSeq和新 Nextera Rapid Capture Enrichment kits。

高丰度的宿主DNA，往往会影响微生物组的分析，而靶向富集技术成为了微生物组分析的福音。“由于宿主DNA的影响，测序人体一些区域的微生物组非常昂贵，”Stewart说。“为此,我们开发了以宿主甲基化为基础的NEBNext微生物组DNA富集试剂盒，目前已有不少用户将该方法应用到了人类等多种生物的样本中。”

样品制备的自动化

将NGS的样品制备流程自动化，不仅能够让使用者省心省力，还能够在提高通量的同时显著减少人为误差。自动化仪器与试剂盒结合，为DNA纯化、文库构建和片段筛选大大提速。这种自动化方案同样适用于一些棘手样本，例如从FFPE样品中提取核酸。

贝克曼的SPRIselect试剂盒旨在利用磁珠对DNA片段进行筛选，现在这一技术已经在Biomek 4000和Biomek FXP平台上实现了自动化。此外，贝克曼还与Illumina合作为其NGS样品制备试剂盒实现自动化，包括TruSeq、Nextera和Epicentre系列。其中TruSeq Stranded mRNA kit是最近发布的新产品。

据Jackson介绍，随着样品制备试剂盒越来越简便可靠，将这些试剂盒自动化也越发容易。例如，Illumina的DNA PCR-free kit和Nextera kit就是为高通量而设计，不仅易于自动化，更能提高实验效率，增加数据的可信度。

此外，贝克曼也为中小型实验室开发了自动化系统。“Biomek 4000实现了qPCR setup和AMPure XP cleanup的自动化，在NGS样品制备过程中，我们能为研究者们提供关键步骤的自动化和价格实惠的试剂，”Jackson说。“自动化方案可在两小时内处理多达192个高质量样本，并能直接用于下游步骤。”

Advanced Analytical Technologies公司针对样品制备的质量，开发了自动化评估系统。该公司的Fragment Analyzer™ Automated CE系统利用毛细管电泳和荧光染料，来评估样品中的核酸。该系统可同时运行12或96个样本，处理10 bp至40,000 bp的DNA片段，分辨率可达2-bp。