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蛋白质印迹手册11:影响免疫检测的因素(上)

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年6月23日 来源:默克密理博

摘要:

  影响免疫检测的因素有很多,包括缓冲液、封闭、抗体、清洗、检测底物等等。了解下列章节中提出的有关免疫检测的概念,将有助于优化特定样品的操作。

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了解下列章节中提出的有关免疫检测的概念,将有助于优化特定样品的操作。

  • 缓冲液

最常用的两种缓冲液是磷酸盐缓冲液(PBS)和Tris缓冲液(TBS)。调整配方中缓冲液组分的各种改良配方已见诸期刊。缓冲液的关键要求是它应有助于保持抗体的生物活性。因此,离子强度和pH值应相当接近生理状态。PBS的配方(磷酸盐总浓度10 mM)适用于广泛的抗体和检测底物。

在孵育过程中,装有膜的容器应轻轻摇动。缓冲液的量应足够,完全覆盖膜,使其在缓冲液中自由漂浮。如果不止一张印迹放在容器中,缓冲液容量不足会导致印迹膜粘在一起。这将影响孵育溶液的充分接触,导致各种假象,如背景高、信号弱和灵敏度不均匀等。

  • 封闭

要获得有意义的结果,必须保证抗体只与感兴趣的蛋白质结合,而不与膜结合。利用惰性蛋白、非离子去污剂,或无蛋白的封闭剂(如Bløk® noise-canceling试剂)来封闭膜上未被占据的位点,可减少抗体的非特异结合(NSB)。封闭剂与膜的亲和力应高于抗体。它应填满膜上未被占据的位点,但不会替换膜上的目标蛋白。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白(BSA,0.2-5.0%)、脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、吐温20去污剂的稀释液(0.05-0.1%)以及Bløk®试剂。研究表明,吐温20去污剂对抗原有复性的作用,从而能够提高特异抗体对抗原的识别(Van Dam等,1990;Zampieri等,2000)。其他去污剂,如Triton® X-100去污剂、SDS和NP-40,有时也会使用,但可能会太过剧烈而破坏了蛋白之间的相互作用。封闭剂通常溶解在PBS或TBS中。

与封闭相关的风险包括:选择不适当的封闭剂或过量封闭会替换或掩盖目标蛋白质。因此,封闭剂的正确选择对成功的免疫检测很关键。例如,奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白标记的抗体,因为牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特异性抗体对磷酸化蛋白进行检测分析时,如果采用粗蛋白制剂作为封闭剂,由于这些制剂中可能含有磷酸酶,而印迹上的磷酸化蛋白会被这些酶去磷酸化,就有可能会影响分析结果。研究表明,在封闭液中添加磷酸酶抑制剂可增强磷酸化特异性抗体的信号(Sharma和Carew,2002)。此外,适用于一种抗原-抗体组合的封闭剂可能不适用于其他组合。

封闭剂和检测试剂之间的兼容性可通过操作1.5(第41页)中介绍的斑点印迹方法来确定。封闭液被点样在空白的PVDF膜上,而膜已在甲醇中浸润,并在TBS中平衡。随后在印迹上添加检测试剂,孵育5分钟,并曝光在X射线胶片上。暗斑的出现则表明封闭剂与检测试剂不兼容(图19,第42页)。必须记住,与Immobilon®-P转印膜相比,Immobilon®-PSQ转印膜的表面积更高,孔径更小,可结合更多的蛋白质。如果在标准的Western印迹操作中用Immobilon®-P转印膜来替代Immobilon®-PSQ转印膜,那么封闭液可能不足以饱和膜表面。可能需要更多的清洗步骤来降低背景。利用斑点印迹方法,可方便地优化封闭(第40页)。

  • 抗体

在封闭之后,印迹与一个或多个抗体孵育。第一个抗体与目标蛋白结合,而第二个抗体与第一个结合。第二个抗体结合有酶或染料,可用来指示蛋白的位置。

尽管一抗能直接标记,但使用二抗有明显的优势。首先,不止一个二抗分子能够与单个一抗分子结合,形成信号扩增。其次,标记的二抗(酶-抗体结合物)可用于大量不同特异性的一抗,从而不再需要标记多个一抗。

多克隆或单克隆的一抗都可使用。多克隆抗体通常是以抗血清或亲和纯化的抗体形式提供的。单克隆抗体是在腹水或组织培养液中表达的,可直接使用或进行亲和纯化。一定要记住,变性蛋白可能无法被天然抗原培育出的抗体所识别。在某些情况下,可能需要非变性凝胶来进行印迹。抗体以缓冲液和封闭液稀释,以避免与膜的非特异结合。抗体稀释液通常也包含痕量的吐温20或另一种去污剂,以防止抗体的非特异聚集。许多发表的化学发光操作需要在封闭液和抗体稀释液中添加0.1%(v/v)吐温20。我们必须认识到,高于0.05%(v/v)的浓度有可能从膜上洗掉一些印迹的蛋白质。

提高吐温20去污剂的浓度通常会降低背景。一种更简单且更经济的策略是降低抗体的浓度,特别是二抗(详见图12)。抗体必须特异针对目的蛋白,不能与封闭液中的组分交叉反应,且应该是相对纯净的。其他蛋白质或聚集物形式的杂质会导致非特异性结合和背景增高。

免疫检测是一种极其灵敏的方法。为了实现高的信噪比和最高的灵敏度,一抗和二抗的浓度应针对每种情况来优化。一般来说,高倍稀释一抗或降低凝胶上的蛋白上样量可减少非特异信号。高倍稀释酶标记的二抗可最大限度降低整体的高背景。

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