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蛋白质印迹手册22:故障排查(上)[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年9月11日 来源:默克密理博

摘要:

  蛋白质印迹出了问题?没关系,下面的troubleshooting指南一定能帮助你找出可能的原因,并为你提供补救办法。

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1. 斑点(过滤)印迹

症状

可能的原因

补救办法

样品滤过膜的流速慢或无法滤过

真空不够

确保印迹装置已正确关闭,且密封完好。

确保真空源(如泵)运行正常。

用高品质的实验室胶带密封所有开孔。提高真空水平。

膜的孔被堵塞

离心或过滤样品,以去除颗粒。

用缓冲液稀释粘稠的样品。

在印迹上观察到很少蛋白或无蛋白

上样到膜上的蛋白质不够

最大限度减少样品稀释,过滤更多的样品。

去污剂(如SDS)可能抑制低分子量蛋白质与膜的结合

如有可能,去除去污剂。

染色不够灵敏

使用更加灵敏的染料。

染色的印迹不均一

膜的结构被滤纸压缩

在印迹装置中放置第二张膜,以保护接收样品的膜。

气泡截留在膜的内部

将膜放在甲醇表面,预润湿膜。浸没膜可能会截留空气。

膜未在甲醇中预润湿

膜必须用甲醇预润湿;整张膜应均匀地从不透明变为半透明。

样品中有气泡

小心移液孔中的样品,以避免气泡形成。

上样量不够

样品必须覆盖整个暴露的膜区域。

膜上面的蛋白弥散

孔中的样品渗漏

在过滤前确保印迹装置正确组装、关闭和密封。

膜背面的蛋白弥散

超过了膜的容量

减少孔中的蛋白上样量。

2. 半干转印或槽转印

症状

可能的原因

补救办法

条带弥散/扭曲

膜未在甲醇中均匀润湿

整张膜必须用甲醇预润湿;整张膜应均匀地从不透明变为半透明。

膜下以及堆积层的其他各层之间存在气泡

在组装堆积层时,利用移液管或搅拌棒,轻柔滚动以去除任何截留的气泡。

凝胶和膜之间的接触不均匀

确保整张凝胶和膜的表面有良好接触。

在转印过程中产生太多热

运行的温度不应超过20°C。对于槽转印,预冷缓冲液,或在冷室中开展转印。对于半干转印,要么缩短运行时间,增加滤纸数量,要么降低电流。

在半干转印过程中滤纸变干

在转印之前确保滤纸彻底湿透,或使用更多滤纸。确保堆积层在15分钟内组装好。

蛋白质转印太快;蛋白质累积在膜表面

降低电场强度。

信号弱

蛋白质穿过膜

将电压降低最多50%,增加蛋白质必须与膜接触的时间。

高负电荷的蛋白质(由于天冬氨酸和谷氨酸含量高)往往在电场中非常快速地移动。降低电压,以减慢这些蛋白质的迁移。

凝胶中SDS的存在可能抑制蛋白质的结合。在转印缓冲液中平衡凝胶至少15分钟。

转印缓冲液中甲醇浓度太低,不利于SDS的去除。将甲醇增加至15-20%,特别是对于较小分子量的蛋白质。

膜必须用甲醇预润湿;整张膜应均匀地从不透明变为半透明。

蛋白质保留在凝胶中

如果转印缓冲液中的甲醇浓度过高,它会去除蛋白质中的SDS,导致蛋白沉淀在凝胶中。这会降低高分子量蛋白质的转移。如果蛋白沉淀是个问题,那么可在转印缓冲液中添加SDS0.01%-0.05%),以提高溶解度。此外,过量甲醇往往收缩或收紧凝胶,从而抑制大分子量蛋白质的转移。

蛋白质的等电点处于或接近转印缓冲液的pH

等电点与转印缓冲液的pH值相同的蛋白质将无净电荷,因而不会在电场中迁移。为了促进转移,尝试更高pH值的缓冲液,如10 mM CAPS缓冲液(pH 11),包括10%甲醇,或较低pH值的缓冲液,如乙酸缓冲液。

当凝胶和/或转印缓冲液中使用尿素时,检测不佳

通过循环的缓冲液设置,或在冷室中运行转印,来降低温度。尿素受热会引起蛋白质的氨基甲酰化,从而改变蛋白质中氨基酸的电荷。这会影响抗体识别和结合所必需的表位。

蛋白质转移不彻底

对凝胶染色,以检查残留蛋白质。如果转移不彻底,请检查您的转印技术。

蛋白质保留不佳

一旦转印完成,确保膜彻底干燥,以实现蛋白质的最佳结合和固定。这应在下游检测之前完成。

无信号

蛋白质未转移

检查转移过程中凝胶和膜的方向。使用预染的分子量标准品来监控转移。

小分子量蛋白质的转移不佳

蛋白质保留不够,SDS干扰小分子量蛋白质的结合

换用Immobilon®-PSQ转印膜。去除转印缓冲液中的SDS

转印缓冲液中的甲醇浓度低

在转印缓冲液中使用较高比例的甲醇(15%-20%)。

蛋白质结合的时间不够

较低电压可优化小蛋白与膜的结合。

电流不能穿过膜。

将膜和滤纸切成与凝胶相同的大小;切勿超出。

大分子量蛋白质(~ >80 kDa)的转印不佳

甲醇浓度过高

甲醇浓度降低至10%v/v)或以下能让凝胶溶胀,从而协助大分子量蛋白的转移。而且,较低比例的甲醇也会减少蛋白的SDS损失,减少凝胶中的蛋白沉淀。对于SDS对膜结合的干扰,>200 kDa的蛋白质不如<100 kDa的蛋白质灵敏。

正电荷蛋白质的转移不佳

蛋白质在转移缓冲液中带正电荷;蛋白质向阴极移动。

反转转印堆积层,让Immobilon® 转印膜在凝胶的阴极一侧。

半干转印不佳

电流绕过凝胶堆积层

确保膜和滤纸切成与凝胶相同的大小,切勿超出。

各种大小的蛋白质转移不佳

转移大蛋白和小蛋白需要不同的条件

请参考“宽分子量范围蛋白质的转移可能需要多步的转移”(T. Otter et al., Anal. Biochem. 162:370-377 (1987)

在半干转印中使用三缓冲液系统

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立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

(http://www.ebiotrade.com/)

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