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蛋白质印迹手册23:故障排查(下)[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年9月12日 来源:默克密理博

摘要:

  蛋白质印迹出了问题?没关系,下面的troubleshooting指南一定能帮助你找出可能的原因,并为你提供补救办法。

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3. 蛋白质观察

症状

可能的原因

补救办法

透照法检测不佳

膜不合适

透照法最适合Immobilon®-P转印膜。不建议使用硝酸纤维素或Immobilon®-PSQ转印膜。

在用甲醇润湿前,膜未彻底干燥

确保膜在转印后彻底干燥,才浸入20%的甲醇溶液中。一定要使用20%的甲醇溶液。

印迹只用水饱和

20%甲醇饱和印迹。

印迹不够饱和

将甲醇浓度提高到最多40%

染色弱或不均匀

膜在染色前未用甲醇润湿

膜必须用甲醇预润湿;整张膜应均匀地从不透明变为半透明。

不均匀/有污点的结果

使用足够量的孵育溶液,并确保孵育过程中膜被这些溶液完全覆盖

所使用的容器应足够大,让溶液在印迹上自由移动。每次切勿在同一个容器中孵育超过一张印迹。此外,印迹的蛋白质一侧应朝上,这样就不会与容器的底面相互作用。

气泡

印迹的表面不应有任何气泡。沿容器边缘轻拉膜,以赶走气泡。

试剂质量不佳

所有的缓冲液和试剂应当是新鲜的,不含颗粒和污染物。使用Millex® 针头式过滤器或Stericup®Steritop® Steriflip®过滤装置来过滤缓冲液,抗体储液可能需要离心。

背景染色高

蛋白质与膜的非特异性结合

确保使用干净的电转移设备和组件,以及高质量的试剂和Milli-Q® 水。

4. 免疫检测

症状

可能的原因

补救办法

信号弱

封闭试剂不适当

封闭剂可能对目的蛋白有亲和力,从而掩盖了蛋白,影响检测。尝试不同的封闭剂和/或降低封闭剂的量或暴露时间。

抗体孵育时间不够

增加孵育时间。

抗体浓度太低,或抗体无活性

抗体溶液的反复冻融或细菌污染可能改变抗体的滴度或活性。提高抗体浓度或新鲜制备。

检测试剂过期

使用新鲜的底物并适当保存。过期的底物会降低灵敏度。

蛋白质转印的问题

优化蛋白质转印(见上文)。

显色检测中的印迹干燥

如果使用显色检测系统,对比度不佳,那么印迹可能已干燥。尝试用水重新润湿印迹,以便最大限度提高对比度。

自来水让显色检测试剂失活

在准备试剂时使用Milli-Q® 水。

叠氮化物抑制HRP

请勿在封闭液中使用叠氮化物。

抗原浓度太低

转印之间在凝胶中上样更多的抗原。

无信号

抗体浓度太低

增加一抗和二抗的浓度。

HRP抑制

HRP标记的抗体不应使用在包含叠氮化钠的溶液中。

一抗是针对天然蛋白的

在非变性凝胶中分离蛋白质,或使用针对变性抗原的抗体。

不均匀的印迹

印迹上出现指纹、折痕或镊子痕迹

不要触摸或折叠膜;使用手套和钝端镊子。

有污点的背景

封闭试剂中有结块

通过0.2 μm0.45 μmMillex® 针头式过滤器装置来过滤封闭液。

HRP标记的二抗中有聚集物

通过0.2 μm0.45 μmMillex® 针头式过滤器装置来过滤二抗溶液。

背景高

清洗不够

增加清洗量和次数。利用Millex® 针头式过滤器或Steriflip®过滤装置来预过滤所有溶液,包括转印缓冲液。

二抗(酶结合)抗体浓度过高

增加抗体稀释度。

蛋白质之间相互作用

在清洗和检测溶液中使用吐温200.05%),以减少蛋白质之间相互作用,并提高信噪比。

Immobilon®-PSQ转印膜上的免疫检测

增加封闭液的浓度或量,以补偿更大的膜表面积。在清洗缓冲液中加入最多0.5 M NaCl0.2% SDS,并将清洗时间延长至2小时,可减少顽固的背景。

试剂质量不佳

使用高质量的试剂和Milli-Q® 水。

封闭液和抗体之间的交叉反应性

使用不同的封闭液或在清洗液中加入吐温20去污剂。

胶片曝光过度

缩短曝光时间。

孵育过程中膜变干

在孵育过程中使用足量溶液,以覆盖膜。

抗体质量不佳

使用高亲和力的纯化抗体。

检测试剂过量

在曝光前彻底排干印迹。

顽固背景

非特异性的结合

使用高盐清洗。(操作3.4,第54页)

症状

可能的原因

补救办法

背景高(快速免疫检测)

在快速免疫检测过程中膜湿透

减少抗体稀释液中的吐温20< 0.04%)去污剂。

在孵育过程中轻柔摇动。

在电转移之后用Milli-Q® 水冲洗印迹,以去除凝胶上残留的SDS。在开始任何检测操作之前,确保印迹彻底干燥。

免疫检测之前膜用甲醇润湿

切勿预润湿膜。

免疫检测之前膜未彻底干燥

确保膜已彻底干燥,再开始检测。

非特异结合

一抗浓度过高

增加一抗稀释度。

二抗浓度过高

增加二抗稀释度。

抗原浓度过高

降低凝胶上蛋白的上样量。

胶片上图像倒转(黑色背景上出现白色条带

太多HRP结合的二抗

降低HRP结合的二抗浓度。

小蛋白的检测不佳

小蛋白被大的封闭分子(如BSA)所遮蔽

考虑使用酪蛋白或低分子量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

表面活性剂,如吐温和Triton® X-100应减少。

避免用抗体和清洗液孵育过长时间。

5. 荧光检测

症状

可能的原因

补救办法

整体背景高

印迹膜的背景荧光高

使用Immobilon®-FL转印膜。

封闭试剂未针对荧光检测而优化

使用Bløk®-FL Noise-canceling试剂,为荧光Western印迹而优化。

多重分析的问题

实验设计

两个抗体必须来自不同的宿主物种,这样它们才能被不同特异性的二抗所区分。在使用两个一抗之前,需要分别在单独的印迹上检测条带模式,以确定条带出现的位置。在双色检测中应使用交叉吸附过的二抗。

背景有污点

处理印迹时有灰尘/粉末颗粒

戴上无粉尘手套处理印迹,并清洁扫描仪的表面。

信号低

湿的印迹

干燥印迹可提高信号强度。印迹可重新润湿后再扫描。在扫描时切勿用保鲜膜或Saran™膜包住印迹。

印迹光漂白

尽管荧光染料通常能提供持久的稳定信号,但一些荧光染料会很容易发生光漂白。为了防止光漂白,在二抗孵育和清洗时应保持让膜避光,直至准备进行扫描。将显像好的印迹保存在暗处,以便后续成像。

错误的激发波长

在印迹成像或使用发射滤光片时遵照染料制造商的使用说明。

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(http://www.ebiotrade.com/)

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