蛋白质印迹手册19:快速的免疫检测方法[创新技巧]

【字体: 时间:2014年09月04日 来源:默克密理博

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  快速免疫检测的优点是不需要封闭,节省时间,避免相关的风险(Mansfield,1994)。同时,因为过量的抗体不会与干燥的膜结合,所需的清洗次数也减少。因此,分析的总时间在2小时以下,而标准方法需要4小时以上。

快速免疫检测利用了抗体不能与未润湿的Immobilon®-P转印膜的疏水表面结合,但能与膜上固定的蛋白质结合的事实。快速免疫检测均可与显色底物和化学发光底物兼容。

提示:使用快速免疫检测方法可快速观察较高丰度的蛋白质。若需要更高的灵敏度,请使用标准的免疫检测方法。

快速免疫检测的优点是不需要封闭,节省时间,避免相关的风险(Mansfield,1994)。同时,因为过量的抗体不会与干燥的膜结合,所需的清洗次数也减少。因此,分析的总时间在2小时以下,而标准方法需要4小时以上。

切记:在开始快速免疫检测之前,印迹必须彻底干燥。

必需的溶液
• 一抗(目的蛋白特异的)。
• 二抗(一抗特异的),标记碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
• 适合酶的底物。
• 磷酸盐缓冲液(PBST):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl。
• 抗体稀释液:1%(w/v)BSA(牛血清白蛋白),0.05% 吐温20去污剂。
• 封闭液:1%(w/v)BSA(牛血清白蛋白),0.05% 吐温20。
• 甲醇,100%。
• Milli-Q® 水。

必需的设备
• 浅托盘,大小能容纳印迹膜。
• 保鲜膜(如Saran™)、冷冻袋或纸片。
• 放射自显影胶片和暗盒。
• 暗室和放射自显影胶片冲洗设备。

准备
1. 利用操作1.7 膜干燥方法,第44页,让印迹彻底变干。切勿让甲醇再次润湿印迹。
2. 用稀释液将一抗稀释到所需的工作浓度。
3. 用稀释液将二抗稀释到所需的工作浓度。
注意:应准备足够的溶液,让每cm2 膜有0.1 mL抗体溶液(一抗和二抗)。

抗体孵育
1. 将印迹放入一抗溶液中,摇动孵育1小时。溶液应在膜表面自由移动。
2. 将印迹放入PBS中,清洗5分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
3. 将印迹放入二抗溶液中,摇动孵育30分钟。
5. 将印迹放入PBS中,清洗5分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
6. 继续进行显色、化学发光或荧光检测,如操作3.1 标准免疫检测方法(第48页)所述。

利用SNAP i.d.® 2.0系统进行快速的免疫检测

SNAP i.d.® 2.0蛋白质检测系统是第二代的SNAP i.d.® 方法,可检测Western印迹上具有免疫反应的蛋白质。有了这种独特的真空驱动系统,试剂被“拉”过膜,增加了试剂与膜内部的接触,而不必依靠缓慢的扩散和摇动。这种改良的三维的试剂分布可减少免疫检测所需的时间长度。在传统的Western印迹中,封闭、抗体孵育和清洗步骤需要4-24小时,而SNAP i.d.® 2.0只需要30分钟,且不会损失信号强度或降低印迹质量。蛋白质转移到膜上之后的所有免疫检测步骤(即封闭、清洗以及一抗和二抗孵育)可在SNAP i.d.® 2.0系统中开展。

必需的溶液
• 封闭液,如脱脂/低脂奶粉(0.5%或以下)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)或其他市售的封闭剂,如Bløk®-CH试剂。
• 抗体(单克隆和/或多克隆)。
• 检测试剂。
• 清洗液:Tris或磷酸盐缓冲液,pH 7.4,添加吐温20表面活性剂(TBST或PBST)。

必需的设备
• 真空源:泵或其他均一的真空源,可提供稳定持续的最小压力达到410毫巴(12英寸汞柱)的和34L/min。
• 注意:默克密理博WP61系列化工型泵可以使用,但可能需要较长的处理时间。
• 一升或更大的真空瓶,带瓶塞(用于废液收集)。建议在真空瓶和真空源之间使用Millex®-FA50过滤器(或类似产品),以避免真空源被污染。
• 真空管,连接真空瓶和真空源。
• 镊子。
• 带有转移蛋白的印迹。


准备
1. 将SNAP i.d.® 2.0底座放在水平台面上。
2. 将真空管连接到系统背面,将管子一端的接头推入系统底座背面的快速断开装置,直到听到咔嗒一声。
3. 将管子的另一端与真空源连接。使用一升的真空瓶作为真空肼,并使用Millex®-FA50过滤器(货号SLFA05010),以避免真空源被污染。
注意:任何可提供410毫巴(12英寸汞柱)和34L/min的真空源已足够。如果真空源在高于410毫巴下操作,SNAP i.d.® 2.0系统将自动调节真空压力。

印迹组装 & 常规操作
1. 按住印迹支架的支持层(蓝色边),用湿托盘中提供的蒸馏水将膜层(白色)润湿。将润湿的印迹支架放在滚动垫上。
2. 如有必要,用甲醇和水预润湿印迹,然后将其放在印迹支架的中央,蛋白质一面朝下。
3. 用印迹滚筒在印迹上轻柔滚动以去除气泡,然后盖上印迹支架,再滚动一次。
4. 打开印迹支架框,反转印迹支架,让蛋白质一面朝上,然后放回印迹支架框中。印迹支架的缺角可确保它正确放置在框内。
5. 盖上并锁住印迹支架框。加入30 mL封闭液。按下印迹支架框,打开系统旋钮,施加真空。当印迹支架框彻底清空时,关闭真空。
6. 在印迹支架的表面加入5 mL(对于Mini印迹)或10 mL(对于Midi印迹)一抗。
7. 室温下孵育10分钟。溶液将吸收到印迹支架内,而表面可能看上去是干的。
8. 按下框架,施加真空。等待5-8秒后,框架彻底清空。
9. 让真空持续,加入30 mL清洗液。重复清洗步骤3次(总共4次清洗)。当框架彻底清空时,关闭真空。
10. 在印迹支架的表面均匀加入5 mL(对于Mini印迹)或10 mL(对于Midi印迹)二抗。室温下孵育10分钟,此时真空关闭。同样,溶液将吸收到印迹支架内,而表面可能看上去是干的。
11. 按下框架,施加真空。等待5-8秒后,框架彻底清空。让真空持续,加入30 mL清洗液。重复清洗步骤3次(总共4次清洗)。
12. 关闭真空,从框架中取出印迹支架。从中取出印迹,与适当的检测试剂一起孵育。

一抗时间延长
孵育:1小时至过夜
1. 开展一般操作的第1-5步。
2. 加入5 mL(对于Mini印迹)或10 mL(对于Midi印迹)1X一抗(传统免疫检测中通常使用的浓度)。
3. 用盖子盖住印迹支架框。如有必要,从底座中取出,摇动孵育。若需要过夜孵育,建议冷藏。尽管印迹支架的表面可能看起来有些干燥,但印迹不会变干,因为框架内包含溶液。
注意:如果不止一个印迹需要延长时间,印迹支架框可堆叠,以减少存储空间。
4. 可选:如果要回收一抗,在第4步操作之前将抗体回收托盘放入底座。
5. 延长孵育时间后,将框架放回底座,去除液体,并按照一般操作的第8-12步操作。
注意:对于SNAP i.d.® 2.0系统来说,延长二抗的孵育时间是不必要的。建议使用5X浓度的二抗,孵育10分钟。

抗体回收
1. 开展一般操作的第1-5步,但将真空时间增加至2分钟,以确保所有封闭液从框架的凹槽和通道中去除。
2. 从底座中取出印迹支架框,用纸巾擦去框架底部的所有残留液体。
3. 将抗体收集托盘放入底座中,确保托盘的定位孔与底座的定位针对齐。
4. 将印迹支架框放回底座中。
5. 加入一抗,并按照一般操作中的第6-7步孵育。
6. 孵育10分钟后,打开真空,等待1分钟,以确保所有抗体已被收集。
注意:在同时处理两个框架时,先在一侧施加真空,再在另一侧。这确保每个框架都有完全的真空力,并改善回收量。
7. 关闭真空,取出框架。取出抗体回收托盘。
8. 将抗体转移至适当的容器内,以便保存或分析。
9. 将印迹支架框放回去,继续一般操作的第9步。

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