用户名:

密 码:

测序 | miRNA | 表观遗传 | 蛋白研究 | 细胞研究 | 免疫学 | 转染 | PCR | qPCR | 核酸纯化 | 基因表达

您所在的位置:首页 > 新技术专栏

蛋白质印迹手册19:快速的免疫检测方法[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2014年9月4日 来源:默克密理博

摘要:

  快速免疫检测的优点是不需要封闭,节省时间,避免相关的风险(Mansfield,1994)。同时,因为过量的抗体不会与干燥的膜结合,所需的清洗次数也减少。因此,分析的总时间在2小时以下,而标准方法需要4小时以上。

分享到:
  

快速免疫检测利用了抗体不能与未润湿的Immobilon®-P转印膜的疏水表面结合,但能与膜上固定的蛋白质结合的事实。快速免疫检测均可与显色底物和化学发光底物兼容。

提示:使用快速免疫检测方法可快速观察较高丰度的蛋白质。若需要更高的灵敏度,请使用标准的免疫检测方法。

快速免疫检测的优点是不需要封闭,节省时间,避免相关的风险(Mansfield,1994)。同时,因为过量的抗体不会与干燥的膜结合,所需的清洗次数也减少。因此,分析的总时间在2小时以下,而标准方法需要4小时以上。

切记:在开始快速免疫检测之前,印迹必须彻底干燥。

必需的溶液
• 一抗(目的蛋白特异的)。
• 二抗(一抗特异的),标记碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
• 适合酶的底物。
• 磷酸盐缓冲液(PBST):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl。
• 抗体稀释液:1%(w/v)BSA(牛血清白蛋白),0.05% 吐温20去污剂。
• 封闭液:1%(w/v)BSA(牛血清白蛋白),0.05% 吐温20。
• 甲醇,100%。
• Milli-Q® 水。

必需的设备
• 浅托盘,大小能容纳印迹膜。
• 保鲜膜(如Saran™)、冷冻袋或纸片。
• 放射自显影胶片和暗盒。
• 暗室和放射自显影胶片冲洗设备。

准备
1. 利用操作1.7 膜干燥方法,第44页,让印迹彻底变干。切勿让甲醇再次润湿印迹。
2. 用稀释液将一抗稀释到所需的工作浓度。
3. 用稀释液将二抗稀释到所需的工作浓度。
注意:应准备足够的溶液,让每cm2 膜有0.1 mL抗体溶液(一抗和二抗)。

抗体孵育
1. 将印迹放入一抗溶液中,摇动孵育1小时。溶液应在膜表面自由移动。
2. 将印迹放入PBS中,清洗5分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
3. 将印迹放入二抗溶液中,摇动孵育30分钟。
5. 将印迹放入PBS中,清洗5分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。
6. 继续进行显色、化学发光或荧光检测,如操作3.1 标准免疫检测方法(第48页)所述。

利用SNAP i.d.® 2.0系统进行快速的免疫检测

SNAP i.d.® 2.0蛋白质检测系统是第二代的SNAP i.d.® 方法,可检测Western印迹上具有免疫反应的蛋白质。有了这种独特的真空驱动系统,试剂被“拉”过膜,增加了试剂与膜内部的接触,而不必依靠缓慢的扩散和摇动。这种改良的三维的试剂分布可减少免疫检测所需的时间长度。在传统的Western印迹中,封闭、抗体孵育和清洗步骤需要4-24小时,而SNAP i.d.® 2.0只需要30分钟,且不会损失信号强度或降低印迹质量。蛋白质转移到膜上之后的所有免疫检测步骤(即封闭、清洗以及一抗和二抗孵育)可在SNAP i.d.® 2.0系统中开展。

必需的溶液
• 封闭液,如脱脂/低脂奶粉(0.5%或以下)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)或其他市售的封闭剂,如Bløk®-CH试剂。
• 抗体(单克隆和/或多克隆)。
• 检测试剂。
• 清洗液:Tris或磷酸盐缓冲液,pH 7.4,添加吐温20表面活性剂(TBST或PBST)。

必需的设备
• 真空源:泵或其他均一的真空源,可提供稳定持续的最小压力达到410毫巴(12英寸汞柱)的和34L/min。
• 注意:默克密理博WP61系列化工型泵可以使用,但可能需要较长的处理时间。
• 一升或更大的真空瓶,带瓶塞(用于废液收集)。建议在真空瓶和真空源之间使用Millex®-FA50过滤器(或类似产品),以避免真空源被污染。
• 真空管,连接真空瓶和真空源。
• 镊子。
• 带有转移蛋白的印迹。

上一页 [1] [2] 下一页

(http://www.ebiotrade.com/)

我来说两句(0)

[Ctrl+Enter]

加载读者评论......

相关文章:

    加载相关文章......

今日文章:

    加载今日文章......
    加载中......
    加载中......

技术期刊

GE期刊 | 基因快讯

    加载中......
    加载中......

更多>>

技术大讲堂

分子 | 细胞 | 蛋白 | 其它

    加载中......
    加载中......
    加载中......
    加载中......

更多>>

特价专栏

    加载中......

更多>>

会展信息

    加载中......

更多>>

生物通首页 | 生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 生物直通车 | 科研交流 | 正牌代理商 | 中国科学人 | 新技术专栏 | 技术讲座

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号