CRISPR只是基因组编辑?你已经OUT了

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2015年5月28日 来源:生物通

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  加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna在本期Molecular Cell杂志上发表文章,全面探讨了CRISPR-Cas9在各方面的应用。Doudna是CRISPR技术的共同开发者,曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”(Breakthrough Prize),也是CRISPR专利的有力竞争者。

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生物通报道:很少有发现能够像CRISPR那样在一夜之间改变整个领域。CRISPR-Cas原本是原核生物的适应性免疫系统,自从人们发现了Cas9的应用潜力,这一系统迅速成为了炙手可热的基因组编辑工具。加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna在本期Molecular Cell杂志上发表文章,全面探讨了CRISPR-Cas9在各方面的应用。DoudnaCRISPR技术的共同开发者,曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”(Breakthrough Prize),也是CRISPR专利的有力竞争者。

CRISPR-Cas9基因组编辑

人们发现Cas9的分子功能之后,很快开始用Cas9sgRNA编辑基因组。CRISPR-Cas9让以往费时费力的基因组编辑变成了一件非常容易的事。

引入插入/缺失

Cas9sgRNA的引导下,靶标目的位点并诱导双链断裂DSB,细胞通过NHEJnon-homologous end-joining)将其修复。NHEJ是一个容易出错的修复通路,会产生插入/缺失(indel)破坏开放阅读框,导致基因失活。CRISPR-Cas9在这方面的编辑效率可以高达80%

精确的改变

HDRhomology-directed repair)可以让CRISPR-Cas9的基因组编辑更加精确。将Cas9-sgRNA与供体DNA结合起来,细胞就能用供体DNA作为模板来修复DSB。这一策略可以向目的基因引入新序列或者特定突变,模拟或者矫正致病性的等位基因。不过HDR的效率显著低于NHEJ

染色体重排

CRISPR-Cas9对模式生物进行基因组编辑已经常规化了,人们又发现了一些更有趣的应用。举例来说,同时表达Cas9和多种sgRNA可以实现多重化靶标。除了同时编辑多个染色体位点以外,CRISPR-Cas9还可以删除染色体大片段,这需要两个sgRNA在目标区域两侧诱导DSB。此外,CRISPR-Cas9还可以模拟肿瘤中发生的大规模的染色体重排。

CRISPR-Cas9高通量筛选

最近有不少研究利用CRISPR-Cas9的可编程特性进行全基因组筛选。比如说,用慢病毒sgRNA文库和催化活性的Cas9可以在人类和小鼠细胞中进行功能缺失的基因敲除筛选。这样的筛选可以揭示细胞生存的必需基因,以及涉及特定药物抗性的基因。

失去催化活性的Cas9 (dCas9)也可以用来进行全基因组筛选,它可以直接上调或者下调基因表达。与生成indel的活性Cas9相比,在某些情况下dCas9的转录沉默能够更有效的阻断基因表达。不过dCas9在这方面的最大优势是,介导转录激活子的招募,进行功能获得性筛选。

dCas9调控基因表达

通过点突变失活Cas9的催化活性位点,就会得到dCas9dCas9依然可以在RNA的引导下,实现可编程的DNA结合。人们利用这一点开发了调控基因表达的新工具。

 

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