CRISPR只是基因组编辑?你已经OUT了

【字体: 时间:2015年05月28日 来源:生物通

编辑推荐:

  加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna在本期Molecular Cell杂志上发表文章,全面探讨了CRISPR-Cas9在各方面的应用。Doudna是CRISPR技术的共同开发者,曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”(Breakthrough Prize),也是CRISPR专利的有力竞争者。

  

生物通报道:很少有发现能够像CRISPR那样在一夜之间改变整个领域。CRISPR-Cas原本是原核生物的适应性免疫系统,自从人们发现了Cas9的应用潜力,这一系统迅速成为了炙手可热的基因组编辑工具。加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna在本期Molecular Cell杂志上发表文章,全面探讨了CRISPR-Cas9在各方面的应用。DoudnaCRISPR技术的共同开发者,曾因这一技术获得了“生命科学突破奖”(Breakthrough Prize),也是CRISPR专利的有力竞争者。

CRISPR-Cas9基因组编辑

人们发现Cas9的分子功能之后,很快开始用Cas9sgRNA编辑基因组。CRISPR-Cas9让以往费时费力的基因组编辑变成了一件非常容易的事。

引入插入/缺失

Cas9sgRNA的引导下,靶标目的位点并诱导双链断裂DSB,细胞通过NHEJnon-homologous end-joining)将其修复。NHEJ是一个容易出错的修复通路,会产生插入/缺失(indel)破坏开放阅读框,导致基因失活。CRISPR-Cas9在这方面的编辑效率可以高达80%

精确的改变

HDRhomology-directed repair)可以让CRISPR-Cas9的基因组编辑更加精确。将Cas9-sgRNA与供体DNA结合起来,细胞就能用供体DNA作为模板来修复DSB。这一策略可以向目的基因引入新序列或者特定突变,模拟或者矫正致病性的等位基因。不过HDR的效率显著低于NHEJ

染色体重排

CRISPR-Cas9对模式生物进行基因组编辑已经常规化了,人们又发现了一些更有趣的应用。举例来说,同时表达Cas9和多种sgRNA可以实现多重化靶标。除了同时编辑多个染色体位点以外,CRISPR-Cas9还可以删除染色体大片段,这需要两个sgRNA在目标区域两侧诱导DSB。此外,CRISPR-Cas9还可以模拟肿瘤中发生的大规模的染色体重排。

CRISPR-Cas9高通量筛选

最近有不少研究利用CRISPR-Cas9的可编程特性进行全基因组筛选。比如说,用慢病毒sgRNA文库和催化活性的Cas9可以在人类和小鼠细胞中进行功能缺失的基因敲除筛选。这样的筛选可以揭示细胞生存的必需基因,以及涉及特定药物抗性的基因。

失去催化活性的Cas9 (dCas9)也可以用来进行全基因组筛选,它可以直接上调或者下调基因表达。与生成indel的活性Cas9相比,在某些情况下dCas9的转录沉默能够更有效的阻断基因表达。不过dCas9在这方面的最大优势是,介导转录激活子的招募,进行功能获得性筛选。

dCas9调控基因表达

通过点突变失活Cas9的催化活性位点,就会得到dCas9dCas9依然可以在RNA的引导下,实现可编程的DNA结合。人们利用这一点开发了调控基因表达的新工具。

 


dCas9sgRNA一起在细菌中表达,可以阻止RNA聚合酶与启动子结合,下调特定转录本的表达。人们还将dCas9与特定的效应子结构域融合起来,将转录抑制因子或转录激活因子招募到特定的基因组区域,在真核生物中实现更强的基因表达控制。除此之外,将dCas9与带有表观遗传学标签的效应子结构域融合,还可以特异性的干扰表观遗传学调控。

dCas9的其他用途

dCas9还有一些其它的用途:dCas9GFP融合能够在活细胞中成像DNA位点,进一步揭示基因组特定位置的动态和结构。人们还可以通过dCas9介导的转录调控构建稳固的基因回路,这对于合成生物学来说非常实用。最近还有研究表明dCas9可以结合单链RNA,这意味着在不久的将来人们有望对RNA转录本进行编程操作。

提高CRISPR-Cas9特异性

为了减少CRISPR-Cas9的脱靶效应,人们开发了一系列策略。研究者们用成对的sgRNA引导Cas9切口酶变体,在sgRNA结合的地方造成单链切口(SSB),两个相邻的单链切口会形成一个DNA双链断裂(DSB)。而单个sgRNA造成的SSB能通过碱基切除修复得到精确修复,不引入插入或缺失突变。(相关报道:Nature子刊:黄行许教授解决基因组编辑的脱靶问题

研究者们还对Cas9进行了基因工程改造,让其依赖二聚化才能酶切,就像锌指核酸酶(ZFN)和TALEN那样。研究显示,dCasFok1核酸酶融合之后,DSB形成依赖于FokI的二聚化。二聚化酶对序列的要求更为严格,可以大大减少脱靶位点的数量。Cas9-FokI单体无法进行酶切。(相关报道:三篇Nature子刊:如何克服CRISPR的脱靶效应

人们还发现,适当截短sgRNA可以减少脱靶事件,同时不牺牲正确编辑的效率。只需要缩短gRNA靶标区域的长度,就可以使脱靶突变大幅减少。研究表明,17/18个核苷酸的靶向区域能够比全长gRNA更有效地靶向预定序列。(相关报道:Nature子刊:巧解基因编辑脱靶问题

CRISPR-Cas9的未来

CRISPR-Cas9在医疗领域有着广阔的前景,可以用来矫正致病突变,治疗人类疾病。研究者们也在尝试用这一技术操纵生态群体,比如根据毒力或者抗性基因杀死相应的细菌、快速改变种群性状、控制入侵物种、改良主要农作物等等。此外,CRISPR-Cas9还有着很大的潜力,可以被改造为更强大的研究工具。Doudna指出,这一技术将带领生物学研究进入一个新的时代。

 

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:

Expanding the Biologist’s Toolkit with CRISPR-Cas9

相关新闻
生物通微信公众号
微信
新浪微博
  • 搜索
  • 国际
  • 国内
  • 人物
  • 产业
  • 热点
  • 科普
  • 急聘职位
  • 高薪职位

知名企业招聘

热点排行

    今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号