癌症研究必读2：如何检测癌症相关的体细胞突变

在检测体细胞变异时，研究人员既可以选择一个全面的全基因组方法，也可以选择一个重点的靶向方法，这取决于实验目标、所需通量和现有经费。全基因组测序为发现整个基因组中的体细胞改变提供了一种无假设的方法，而靶向测序让研究人员能够根据先验条件将研究重点放在感兴趣的特定区域。

在检测体细胞变异时，研究人员既可以选择一个全面的全基因组方法，也可以选择一个重点的靶向方法，这取决于实验目标、所需通量和现有经费（表1）。全基因组测序为发现整个基因组中的体细胞改变提供了一种无假设的方法，而靶向测序让研究人员能够根据先验条件将研究重点放在感兴趣的特定区域。在经费一定的情况下，靶向测序能够更深度地覆盖感兴趣的特定区域，实现异质肿瘤中低频率亚克隆的检测，或稀有体细胞变异的检测。

I. 靶向测序方案

与全基因组测序相比，靶向测序有几个关键优势：
•  明显缩小了测序项目的范围
•  减轻了数据分析的总体负担
•  降低了每个样品的测序成本
•  缩短了周转时间

这些优势也让研究人员能够开展深度测序，这对稀有突变的鉴定或异质肿瘤样品中亚克隆的检测至关重要。靶向测序的缺点是可能错过关键的突变，比如存在于基因间或之前未知区域的突变。因此，是选择WGS带来的全面视图，还是选择靶向测序的聚焦能力，这取决于特定研究的目标和现有资源。

外显子组测序

许多致癌变异是在外显子（蛋白质编码区域）中发现的，这一区域大约占了基因组的1%。外显子组测序为肿瘤/正常（T/N）队列分析提供了一种经济且高效的方法。T/N外显子组测序已成为大规模项目的首选，如癌症基因组图谱（TCGA），因为周转时间和价格形成了极具吸引力的组合，也因为它关注最容易解释的基因组区域。

重点测序集合

重点测序集合是预先设计的靶向测序集合，其内容是由领头的肿瘤学专家精心挑选的，并具有高水平的灵敏度，可检测低频率的体细胞变异。Illumina提供了重点集合，它们利用2种不同的技术来选择和测序特定内容：

• 基于扩增子的靶向测序涉及到一个预先的扩增步骤，它利用预设计的引物混合物来靶向感兴趣的特定区域。扩增后的目标随后被纯化和测序。
• 目标捕获涉及到一个预先的DNA捕获或富集步骤，它利用与磁珠结合的预设计捕获探针。

Illumina的靶向测序集合与各种组织类型兼容，包括实体瘤或液体肿瘤，新鲜冷冻或FFPE组织。

定制靶向测序

对于那些有意设计自己的靶向测序集合的研究人员或联盟，Illumina也提供了探针设计软件和定制靶向测序试剂盒，适用于扩增子和目标捕获方法。这两种定制捕获探针或定制扩增子引物都能通过Illumina的DesignStudio™ 软件进行设计和订购。如欲详细了解DesignStudio软件，请访问www.illumina.com/designstudio。

II. 全基因组测序方案

通过全基因组测序（WGS），研究人员可比较T/N样品对，以鉴定整个基因组中编码和非编码区域中的体细胞突变。作为一种无假设的方法，WGS尤其适合新颖的驱动突变的探索。

对于偏爱T/N WGS服务的研究人员，Illumina Genome Network™（IGN）的癌症分析服务开展中等至大型队列的T/N测序研究，适合寻求经济方案的研究人员。如欲详细了解IGN癌症分析服务，请访问www.illumina.com/ign。

体细胞变异检测的数据分析工具

无论是开展全基因组测序、外显子组测序，还是开展靶向测序，Illumina都提供了涵盖一切的无缝流程方案，从文库制备试剂盒和测序平台，到最终的数据分析软件包（图2）。

图2：Illumina的无缝流程方案 – Illumina的测序方案是从DNA到数据的全面整合方案， 从最初的文库制备到最终的数据分析都被覆盖。利用为WGS、外显子组、转录组或靶向测序而优化的试剂盒来制备T/N配对文库。利用MiniSeq™、MiSeq®、NextSeq®或HiSeq®测序系统来开展测序。访问Illumina的数据分析工具来进行比对、变异检出、T/N比较分析或表达谱分析。

数据分析是流程中的最后一步，也是实验成功的关键，必须根据手头的研究问题来设计。例如，变异检出方法必须对多个癌症亚克隆与正常样品污染的复杂性进行适当地建模。Illumina的初步数据分析和体细胞变异检测软件可通过仪器附带的软件轻松获取，如MiSeq Reporter Software和Local Run Manager，也可通过Illumina的的云端基因组计算环境BaseSpace® Sequence Hub获取。数据可从MiniSeq、MiSeq、NextSeq或HiSeq系统直接且无缝地传输到BaseSpace，后者提供了一套应用程序，可满足各种数据分析需求。这些工具被打包在任何用户可访问的用户界面，而不需要生物信息学经验。简单的提示可引导用户走完整个过程，从选择测序仪生成的文件到数据过滤和分析。

对于体细胞变异检测，BaseSpace Tumor Normal App可报告只在肿瘤样品中发现的SNP、插入缺失、拷贝数变异和结构变异。对于基于扩增子的测序集合，MiSeq Reporter以及Somatic Variant Caller可与TruSeq® Amplicon BaseSpace App结合使用。Illumina还提供VariantStudio，一款注释和过滤软件，让用户能创建自定义的变异数据报告，这取决于所使用的集合。如欲了解Illumina完整的变异检测信息学方案，请访问www.illumina.com/informatics.html。

表1：Illumina的癌症DNA测序方案

	主要特点/优点	基因组内容	DNA/RNA起始量	测序深度	数据分析工具
靶向测序
TruSight® Tumor 15	与FFPE兼容 DNA起始量最低 检测等位基因频率<5%的变异，文库制备不到1天	44 kb 250个扩增子，15个基因a	20 ng	最低覆盖度 ≥ 500倍	MiSeq Reporter Predefined Variant Report VariantStudio
TruSight Myeloid Panel	鉴定恶性血液病中的体细胞突变 检测等位基因频率低至5%的变异 文库制备不到1天	141 kb 568个扩增子，54个基因b	50 ng	> 95%的扩增子达到500倍	MiSeq Reporter TruSeq Amplicon Workflow BaseSpace TruSeq Amplicon Core App
TruSight Amplicon Cancer Panel	与FFPE兼容 靶向频繁突变的癌基因中的突变热点 文库制备不到1天	> 35 kb 212个扩增子，48个基因	150 ng （250 ng FFPE）	平均覆盖度为1000倍	MiSeq Reporter TruSeq Amplicon Workflow BaseSpace TruSeq Amplicon Core App
TruSight RNA Pan-Cancer Panel	与FFPE兼容 关注肿瘤学特异的编码区域 为降解的样品或有限的起始材料而优化	1,385个目标基因	10 ng总RNA （20-100 ng FFPE RNA）	每个样品有3M的序列	BaseSpace RNA-Seq Alignment App
TruSight RNA Fusion Panel	与FFPE兼容 检测已知和新颖的基因融合 为降解的样品或有限的起始材料而优化	507个目标基因	10 ng总RNA （20-100 ng FFPE RNA）	每个样品有3M的序列	Local Run Manager RNA Fusion Module BaseSpace RNA-Seq Alignment App
自定义靶向测序
Nextera® Rapid Capture Custom Kits	自定义的基因组内容 0.5-25 Mb的目标序列 文库制备需1.5天	自定义	10 ng	自定义	MiSeq Reporter Enrichment Workflow BaseSpace Enrichment Core Apps
TruSeq Custom Amplicon Low Input	与FFPE兼容 16-1536个扩增子 文库制备不到1天	4-650 kb的目标序列	10 ng总RNA （10-50 ng FFPE）	自定义	MiSeq Reporter TruSeq Amplicon Workflow BaseSpace TruSeq Amplicon Core App
外显子组测序
TruSeq Exome Library Prep Kit	包含编码外显子 文库制备需2.5天	45 Mb 214,405个外显子	100 ng	正常100倍/肿瘤130倍	BaseSpace Enrichment Apps
TruSeq Rapid Exome Library Prep Kit	包含编码外显子 文库制备需2.5天	45 Mb 214,405个外显子	50 ng	正常100倍/肿瘤130倍	BaseSpace Enrichment Apps
Nextera Rapid Capture Custom Expanded Exome Kits	包含编码外显子、UTR、miRNA 文库制备需1.5天	62 Mb 201,121个外显子	50 ng	正常100倍/肿瘤130倍	BaseSpace Enrichment Apps
全基因组测序
TruSeq DNA PCR-Free Library Prep Kits	大大减少文库偏向 出色地覆盖挑战性的区域，如富含GC/AT的区域、启动子以及重复区域	全基因组	1-2 μg	最低值 正常40倍/肿瘤60倍	BaseSpace Core WGS或 T/N Apps
TruSeq Nano DNA Library Prep Kit	为少量DNA样品优化 大大减少文库偏向 改善覆盖均一性	全基因组	100-200 ng	最低值 正常40倍/肿瘤60倍	BaseSpace Core WGS或 T/N Apps

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