数字PCR实现绝对定量之梦

【字体：大中小】 时间：2013年03月22日 来源：生物通

编辑推荐：

　　数字PCR无疑是PCR领域最激动人心的创新之一，这一技术的诞生让许多人绝对定量的梦想成为现实。在许多领域的研究中数字PCR都是难以取代的宝贵技术，包括检测罕见等位基因、在野生型背景下鉴定突变基因、区别低水平的拷贝数变异、验证二代测序结果和基因表达分析等。

生物通报道：数字PCR无疑是PCR领域最激动人心的创新之一，这一技术的诞生让许多人绝对定量的梦想成为现实。定量PCR和数字PCR都能实现对样品中的核酸进行定量，它们之间的差别在于定量PCR依赖于标准曲线和参照基因，而数字PCR则能计数DNA分子进行绝对定量。在许多领域的研究中数字PCR都是难以取代的宝贵技术，包括检测罕见等位基因、在野生型背景下鉴定突变基因、区别低水平的拷贝数变异、验证二代测序结果和基因表达分析等。

数字PCR的基本工作原理很简单，先将样品划分为多个PCR反应，每个反应最多只含有一个目标分子，然后用荧光标记的探针进行检测，计数含有目标分子的反应。正因如此，数字PCR不需要标准曲线，就可以真正实现对样品的绝对定量。不过，这并不意味着dPCR就永远是最好的选择。“尽管数字PCR能够绝对定量，其工作流程也比传统qPCR简单得多，但数字PCR的通量比较低，”Fluidigm公司的分子生物学主管Ramesh Ramakrishnan说。“总的来说，传统qPCR通量更高，而数字PCR的灵敏度和精确性更好。在寻找罕见突变时数字PCR尤其适用。”

分液带来的高精度

样品分液（Partitioning）是决定数字PCR精确性的最重要因素之一。数字PCR通过分液将样品分成小份，通常每一份最多只含有一个拷贝的目标核酸。荧光标记的探针可以用来揭示目标核酸存在与否，并由此获得初始样品中的绝对分子数。“数字PCR这种方法非常简单，一个阳性信号代表着一个目标分子，而没有信号就意味着目标不存在，”Ramakrishnan说。

Life Technologies公司的TaqMan® OpenArray® 数字PCR试剂盒可以在OpenArray® 平板上运行，OpenArray® 平板是一种不锈钢的微流体平板，只有显微镜载玻片大小。这种平板的表面刻有3,072个通孔，每一个通孔都是一个独立的PCR反应孔。每块平板上的通孔排列形成48个子阵列，每个子阵列含64个通孔。OpenArray® 平板的外表面由疏水包被，而通孔内部是亲水包被，由此分隔各通孔中的样品，使其无法彼此接触和混合。

OpenArray® 平板可以在Life Technologies的OpenArray® 实时定量PCR系统和QuantStudio™ 12K Flex 上使用。QuantStudio™ 12K Flex dPCR仪能支持96孔或384孔板、TaqMan® Array卡片和中等密度的OpenArray平板。“QuantStudio™ 12K Flex dPCR仪能够同时运行四个OpenArray平板，一次性生成12,228个单独的PCR循环，并且实时收集PCR扩增的数据，”Life Technologies公司的qPCR资深产品经理Iain Russell说。“OpenArray数字PCR平板的开放性，使研究者们可以根据自身需要，对反应的重复数进行调整，在通量、性能和实验成本之间达到平衡。你可以每种样品只使用一个子阵列，这样运行一次就可以得到192个数字PCR结论。或者你也可以一种样品运行四个平板（192个子阵列），使系统性能和可重复性最大化。”

Fluidigm和Life Technologies采用微流体芯片和微流体通道进行数字PCR。与此不同的是，Bio-Rad选择将样品分为微小的液滴，RainDance Technologies随后也加入了这一行列。“我们的独特优势在于，可以将样品分为1纳升液滴，这些液滴的一致性和可重复性都非常好。通过这一技术，我们可以将每个样品分为20,000个液滴，” Kurtz说。其他系统的分液数量大多在760到3,000之间，“分液数量越多可以使分析更为精确。”由于分液更多，在Bio-Rad的系统中每个液滴能容纳多至五个目标，大大提高了检测的动态范围。“我们的系统可以解析1至100,000个目标拷贝，因此不需要在运行数字PCR之前对样品进行系列稀释，”Kurtz补充道。

去年，RainDance发布了基于RainStorm 微滴技术的新系统。“该系统以The RainStorm 微滴技术为基础，能够以5皮升的样品液滴实现一千万个反应。利用这一技术可以在野生型背景下检测罕见突变，检测目标与野生型背景之比可达到1：200,000。此外，这一系统利用多种浓度的荧光探针，可以实现多重分析。而灵敏度和多重分析能力都是研究者们关注的重点。” RainDance Technologies的数字PCR市场主管Rena McClory说。“这一系统是有力的癌症基因组分析平台，适用于罕见突变检测、生物学指标的绝对定量、肿瘤分析和疾病监控等。在检测罕见突变时，现有数字PCR系统的灵敏度大多在1：5,000左右，而我们的系统可以达到1：200,000。”

系统的灵活性

为了减轻科研人员的负担，数字PCR系统开始附带额外的功能。虽然数字PCR大多始于基因组DNA或cDNA样品，不过已经有一些dPCR系统能够将RNA作为起始样品。在RNA作为起始样品时（例如：基因表达研究或病毒RNA检测），需要进行额外的加工和反转录步骤来得到cDNA。“这增加了手动环节，可能对自动化工作流程产生负面影响，还会增加污染的风险，”Ramakrishnan说。“为了解决这些问题，我们将逆转录酶与化学反应整合在一起形成了一套新方案，能够在现有数字芯片上直接对特定RNA分子进行检测。这不仅会大大推动数字PCR在临床上的应用，也会对普通的基因表达研究产生深远影响。”此外，Bio-Rad还发布了用于基因表达研究的一步法数字PCR试剂盒，One-Step RT-ddPCR Kit for Probes。“现在无需手动完成逆转录再对cDNA分液，而是可以直接对RNA分液，然后在液滴中完成逆转录和PCR，”Kurtz说。“这是从RNA样品到分子计数的理想途径，对此我们非常兴奋。”

Fluidigm公司也在努力使自己的微流体芯片使用起来更灵活，试图让用户可以自行决定每个芯片上检测的样品数，以及每个样品的分液数。“目前，我们一个芯片上最多可以对48个不同样品进行数字PCR，每个样品被分到770个单独的反应室，”Ramakrishnan说，“我们正在开发新的芯片模式，希望能够改变每个芯片上的样品数，以及每个样品所用到的反应孔数。”

有些实验室可能既需要qPCR也需要dPCR，为此Life Technologies提供了可以在二者之间转换的系统。“在数字PCR模式下，许多应用并不需要大量重复，就可以得到合适结果。此时，OpenArray平板的灵活性让用户可以自主选择所需的重复数：为低精度的应用增加样品数，或者为达到高精度应用而使平台性能最大化，”Russell说。“这一系统的灵活性无损于它数字PCR的功能。”

更高的通量

为了适应市场要求，dPCR开发者们正在不断加大这一技术的通量。不过，人们还在期待更加自动化，更能实现多重分析的数字PCR系统。McClory介绍到，“由于荧光探针之间存在光谱交叉，传统qPCR的多重分析能力有限”，因此不少人将多重化的希望寄托在数字PCR上。“多重分析技术可以催生生物指标检测板，从而降低成本和样品消耗，加大通量，并且实现内置的实验对照，”McClory说。

Russell预言dPCR会在不久的将来迎来跨越式的发展。“尽管数字PCR作为一个概念，已经有二十多年历史，但我相信它至今仍处于初级阶段，”Russell说。“不论是从实用性还是从经济性来看，微型化和同时进行大量PCR反应的能力，都使数字PCR有望替代标准qPCR技术。相信在三到五年内，数字PCR就将从一种小众技术发展成为实验室中的标准工具。”