生物通Western Blot技术专辑(续前)  谁可小看“蛋白标准”（下）

谁可小看“蛋白标准”（中）

谁可小看“蛋白标准”（上）

WesternBlot仪器之选

Western Blotting前传：想成为高手吗？

前面已经介绍了3类不同用途的蛋白分子量标准，这里还要特别推荐2个好东东，特别好。 

①“五星级”蛋白标准：MagicMark Western

Invitrogen公司的这一款专门为Western印迹设计的蛋白Marker正如它的名字一样，给使用者带来一种奇妙的感觉：分子量估算精确无误，直接可见、无任何附加步骤和额外的试剂、与目的蛋白同在一张膜上、保持时间长——总而言之，它的诞生可以说是蛋白分子量标准中的新经典。

我们前面说过，蛋白质分子量标准条带越多越好，分布越均匀，参考价值越高。MagicMark蛋白标准的8条带分别是20KD, 30KD, 40KD, 50KD, 60KD, 80KD, 100KD, 120KD，分布得非常均匀，就象Ladder一样，秘诀在于每一个蛋白条带都是在E.coli中的重组蛋白，分子量的区别是通过某一段序列的重复来实现的，更巧妙的是这段重复序列是G蛋白上的IgG结合序列部分——G蛋白高度亲和IgG，所以，这个Marker的每一条带都可以结合一抗的IgG，间接或者直接结合二抗的IgG，跟随着Western印迹一步步的完成，MagicMark上的蛋白也随之完成显示，而且是和目的蛋白同时同地显示，与目的蛋白保持同样长的时间，总而言之，就是“紧紧跟随党的脚步”。这个设计实在巧妙，令人拍案！利用融合在Marker上Protein G特异结合IgG，实现了Marker条带和目标蛋白同时结合抗体，从而实现不需要另外添加任何外源试剂，就可以直接标记在Western Blot结果上——既不需要像未染蛋白标准那样需要剪下来额外染色，也不会像预染蛋白标准那样容易褪色消失和不那么精确，更不会像生物素标记的蛋白标准那样操作繁琐以及条带模糊，或者因为加入额外的试剂而导致假阳性的可能。由于没有标记偶联其他分子，MagicMark显示的是精确真实的分子量大小，加上是Ecoli表达产物，可以高度纯化使得条带非常锐利清晰。所以，MagicMark蛋白标准确实是做到了省时省心，但至于省钱呢，MagicMark250ul包装需要2953人民币，上样时每孔加入2-10ul，即每次WB（一个Marker）23.6元—118元，真是好东西不便宜，不过Invitrogen公司产品定位就是这样，我们也没办法。还是要承认，设计构思的巧妙和使用结果实在太赞了。

另外，MagicMark还是有少少缺点，就是蛋白条带范围还不够广——仅20-120kD 8个蛋白条带，当然这对于一般需要是能够满足了，但如果能将范围扩大到小肽和大分子蛋白的区域，那么就能有更多的实验室人员享受到MagicMark“五星级”的待遇了。现在Invitrogen公司也注意到了这一点，推出了MagicMark XP（不知道是不是和Windows XP一个意思），在原来的8条带基础上增加一个220KD的条带，从而将蛋白条带范围扩大到了20-220kD，为高分子量需求的实验人员提供新的选择。另外还要特别注意的是，我们知道ProteinG对不同来源的IgG的亲和性有一定区别，所以MagicMark对来源于人，马，牛，兔和猪的IgG亲和性很高——也就是说少量Marker就可以很好的显色了；与来源于大鼠，小鼠，豚鼠，山羊，绵羊，爪蟾的IgG结合能力一般，OK，但与来源于鸡的IgG结合能力较差——如果你正好做这个，让我同情你一下，你每次要多用好多Marker了，花钱如流水了，哈哈。不过如果一抗和二抗中有一个亲和力高应该也有助于解决这个问题。还有就是如果是IgM抗体恐怕是有问题的。

②“中西合璧”蛋白标准：Trail Mix™ Western Markers & Blot Kits

有时候当我们用到未染蛋白标准来转膜时，就会想：如果能够在转膜过程中看到条带该多好。之后，预染蛋白标准出现了，但是当我们用预染蛋白标准时，又会觉得：嗯，这种蛋白标准不够精确，不够“标准”嘛。就像生病时，我们拿不准是信西医还是中医一样。如果能够中西合璧，一种Marker包含两种蛋白标准就好啦。

默克公司旗下的Novagen推出的Trail Mix™ Western Markers & Blot Kits就取了这个巧：这种蛋白分子量标准包括了Novagen的Perfect Protein Western Markers和另外三种预染蛋白——Perfect的Ladder是225,150,100,75,50,35,25,15kD，三种预染蛋白分子量大小为15（红色）, 16（蓝色）和100kD（红色）（这样的条带分布比较合理，因为这里预染蛋白并没有起到标定的作用，只是作为指示）。

而且Trail Mix得到的效果是1+1＞2的，因为其中的Perfect Protein上的蛋白带有S-tag和His-tag的融合多肽，可以在Western Blotting过程中跟随着目的蛋白一起通过二抗显色，试剂盒里就有S-protein AP or HRP Conjugate，方便最后显色。