生物通技术盛宴3:磷酸化蛋白和糖基化蛋白的样本制备[选购宝典]

【字体: 时间:2008年01月15日 来源:生物通

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  蛋白质的磷酸化和糖基化,进一步构成了蛋白质极为丰富多彩而复杂的世界。磷酸化蛋白和糖基化蛋白种类之多,丰度变化之多,令这类蛋白样本制备更添难度。

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 蛋白技术篇之蛋白样品制备

特定蛋白质的富集----磷酸化蛋白和激酶

细胞内信号通路失调往往是引起癌变或者肿瘤发生的成因,其特征之一是信号通路成员蛋白质的可逆磷酸化。因此研究细胞信号通路各关键分子的磷酸化水平是分析细胞内信号传导的研究重点之一。 要从芸芸众生中专门发掘磷酸化蛋白,你可能需要ProteoExtract Phosphopeptide Capture Kit。其原理是利用固定化在磁珠表面的锆离子与磷酸基团的特异性相互作用,可从复杂的蛋白样品中特异性并定量地分离磷酸化多肽,可用于磷酸化位点鉴定的激酶反应后的产物,用于LC-MS或MALDI-MS鉴定。从胰酶降解样本中仅需30分钟即可分离出磷酸化多肽组分,固相分离,无需脱盐,适用于不同量的样本,可谓高效、高特异、高重复性。试剂盒提供磷酸化多肽捕获所需的所有试剂,包括锆交换的磁性颗粒、即用型缓冲液等。由于关键纯化介质是磁珠,因此在使用上相当灵活,可根据蛋白量任意调整每次纯化使用磁珠的量,特别适合样本量小的实验,包括从电泳胶条中纯化的蛋白质中分离磷酸化蛋白。¥4396,每个试剂盒最多可用于100次反应(每次反应可从胶条酶解或分离的蛋白样本中得到多达2.5nmol磷酸化多肽)。

Qiagen同类产品名为PhosphoProtein Purification Kit,原理估计都差不多,利用亲和层析技术来分离细胞裂解液中的磷酸化与非磷酸化蛋白,可得到保持有生物活性的蛋白。Q的设计为亲和层析柱,操作上比磁珠方便,但是不够灵活----每个柱子载量很大,可达2.5mg(约107个培养细胞),¥3290/6tests,可纯化次数只有6次,因而每次成本就很高了,适合样本量巨大的实验。值得称道的是试剂盒还提供离心式的超滤纯化柱,方便进一步脱盐浓缩等纯化工作,非常贴心。

ProteoExtract Phosphoprotein Enrichment Kit则是另外一种快捷的富集磷酸化蛋白质的工具,富集后的蛋白可用于SDS-PAGE。试剂盒提供了磷酸化蛋白富集所需的所有试剂,包括裂解液、预装柱、洗脱缓冲液、洗提缓冲液、SDS-PAGE上样缓冲液等。每个试剂盒可用于处理25G哺乳动物组织或100*107个培养细胞,每个试剂盒提供两根预装柱,每根预装柱每次抽提的载量高达20mg磷酸化的卵清白蛋白,处理得当的话,柱子可以重复使用1至2次。可用于从25G哺乳动物组织或100*107个培养细胞中富集磷酸化蛋白。从细胞裂解开始仅需90分钟。

ProteoExtract ProteoEnrich™ ATP-Binders™ 试剂盒则是专门用于如蛋白激酶或者其他ATP结合蛋白的抽提富集。试剂盒含聚丙稀酰胺树脂,系列结合、漂洗、洗脱缓冲液,DTT,蛋白酶抑制剂混合物等,方便快速进行粗裂解物中ATP结合蛋白的抽提富集,并能保持酶活性。每个试剂盒可用于处理17.5 mg粗提蛋白。纯化产物可用于2D电泳、SDS-PAGE、串联质谱、免疫印迹等实验。

蛋白样品制备过程可能导致磷酸酶释出或者其他因素而使目标蛋白的磷酸化状态改变,因此研究中就要特别注意中要防止蛋白质在样本制备过程中意外磷酸化。防止蛋白酶降解,地球人都知道。防止蛋白质磷酸化该如何呢?可在细胞破碎同时选择磷酸酶抑制剂混合试剂,根据目标蛋白可以选择碱性磷酸酶+丝/苏氨酸蛋白磷酸酶混合抑制剂;碱性磷酸酶+酸性磷酸酶+蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂混合物等等。可选择的产品包括罗氏公司的磷酸酶抑制剂混合片,Sigma,Calbiochem也有类似的产品。这类抑制剂可用于组织或细胞蛋白抽提,不受去污剂影响。PhosphoSafe Extraction试剂其实质也就是含有磷酸酶抑制剂混合物的试剂,在从哺乳动物或昆虫细胞中抽提可溶性蛋白时有助于确保相关蛋白的磷酸化状态。产物可用于激酶分析、蛋白相互作用分析、免疫印迹等其他分析、BCA蛋白定量分析。

独一无二的糖基化蛋白分段富集

蛋白质组世界的丰富多彩并不仅仅因为蛋白质本身的多样性和复杂性,另外一个原因是多姿多彩的蛋白质翻译后加工。除了磷酸化蛋白,糖基化蛋白也是近来研究大热的目标。蛋白的糖基化极大的增加了蛋白的多样性和复杂性,更赋予蛋白质更多特殊活性和功能----有数据表明近半数的蛋白质都会经过翻译后糖基化加工----糖基化是蛋白质功能研究中非常重要的一环。对于专注糖蛋白研究的研究人员来说,Qiagen的糖蛋白纯化试剂盒绝对是佳音。利用凝集素可以特异的和糖基进行可逆结合的特性,来对不同的糖蛋白进行分类抽提。试剂盒中提供预装好的凝集素树脂和缓冲液。使用简单。

Qproteome Total Glycoprotein Kit:纯化总糖基化蛋白,细胞裂解液经过试剂盒中提供一种凝集素树脂柱,柱上同时固定有Con A和WGA两种凝集素,可以同时吸附O-linked和N-linked 2大类糖基化蛋白,即可洗脱得到富集的糖基化蛋白。价格都是¥3690/6tests。每次处理样本量大约10的7次方个细胞。

Qproteome Mannose Glycoprotein Kit:纯化富含甘露糖的糖基化蛋白,试剂盒中提供三种凝集素树脂柱,分别固定有ConA,GNA,LCH。按照蛋白所含糖基的凝集素特异性可进一步分为3个部分。

Qproteome Sialic Glycoprotein Kit:纯化富含唾液酸的糖基化蛋白,试剂盒中提供三种凝集素树脂柱,分别固定有WGA,SNA,MAL。按照蛋白所含糖基的凝集素特异性进一步分为3个部分。

Qproteome O-Glycan Glycoprotein Kit:纯化T-抗原型糖基化蛋白,试剂盒中提供两种凝集素树脂柱,分别固定有AIL和PNA。按照蛋白所含糖基的凝集素特异性进一步分为2个部分。

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