生物通技术盛宴4:蛋白酶抑制剂的选择[选购宝典]

【字体: 时间:2008年01月18日 来源:生物通

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  当细胞破碎的时候,蛋白水解酶就会被释放出来或被激活,使电泳结果复杂化,影响最终结果分析。为了避免这些情况的出现,建议在样品制备时尽可能在低温下进行。此外,许多蛋白酶在pH9以上就失活了,因此Tris碱,碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性,此时应当使用蛋白酶抑制剂。因此对于我们想要研究的蛋白来说,选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。

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当细胞破碎的时候,蛋白水解酶就会被释放出来或被激活,使电泳结果复杂化,影响最终结果分析。为了避免这些情况的出现,建议在样品制备时尽可能在低温下进行。此外,许多蛋白酶在pH9以上就失活了,因此Tris碱,碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性,此时应当使用蛋白酶抑制剂。因此对于我们想要研究的蛋白来说,选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。

蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样,都是纷繁复杂的,通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂,如PMSF 和leupeptin。而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用,因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂,如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”,见下表(来自《蛋白质电泳实验技术》)。

蛋白酶抑制剂 有效抑制的酶
PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常见的抑制剂,使用浓度为1mmol/L  不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
AEBSF 丝氨酸抑制剂,使用浓度为4mmol/L  AEBSF的抑制活性与PMSF相近,但它更易溶于水而且毒性低
EDTA,EGTA,使用浓度为1mmol/L 通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制剂,使用浓度为2-20ug/ml  亮肽素(Leupeptin)能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶;抑肽素(pepstatin)抑制天冬氨酸蛋白酶;抑肽酶(aprotinin)能抑制许多丝氨酸蛋白酶;苯丁抑制剂(bestatin)能抑制氨基酸多肽酶
TLCk,TPCK,使用浓度为0.1-0.5mmol/L  不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶
苄脒(Benzamidine)使用浓度为1-3mmol/L  抑制丝氨酸蛋白酶

 

但是这样配置溶液进行处理,有时也是颇为麻烦,而且效果可能并不好,目前有一些厂家试剂在简便操作,和抑制效果方面有不俗的表现,可以考虑在实验中选用,节约时间和便于结果分析。

比如,罗氏的Complete蛋白酶抑制剂混合片也许就能满足这种需要,这种试剂能抑制很多种不同的蛋白酶,包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等,而且可应用于差不多所有的组织或细胞提物,包括来自动物、植物、酵母、细菌和直菌的样品。

除此之外,Complete蛋白酶抑制剂混合片所有成份都稳定和无毒,能提供安全和可靠的保护,这种混和片有不含EDTA的配方,这样就更不会影响依赖金属的蛋白的活性,并可确保有效进行一些纯化工作(如应用Poly-His)标记的蛋白)。

其实重要的是这种片剂操作方便:只要将一片completeTM 加进缓冲液,便可抑制多种不同的蛋白酶,有效地保护目的蛋白,效果明显,免除了称量个别抑制剂的麻烦。而且complete Lysis 1个Kit20次反应,定价为2167(Complete Lysis, bacterial II,其它类型价格差不多),高品质,价格也不高,一举两得,何乐而不为呢?

另外MERCK在抑制剂生产提供方面也实力雄厚,旗下的各大品牌有一千多种不同用途的抑制剂用于信号转导、细胞凋亡、蛋白质组、细胞分化、神经生物等诸多领域。其中也包含了分别适用于细菌、植物、酵母、哺乳动物细胞、重组蛋白、His融合蛋白等不同目的的蛋白酶抑制剂混合物,特异性抑制丝氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶活性的抑制剂混合物、碱性磷酸酶抑制剂混合物、酸性及碱性蛋白酶抑制剂混合物等等。

比如用于广谱蛋白抑制的Protease Inhibitor Cocktail Set I是五种蛋白酶抑制的混合物,广泛抑制多种不同蛋白酶及酯酶的活力,以冻干粉形式提供(每管以1ml水重溶,即可得1ml的100ⅹ储液),方便保存。其它有针对性的蛋白酶抑制剂还有Protease inhibitor cocktail set II(细菌专用)、Protease inhibitor cocktail set III, EDTA-free(哺乳动物细胞和组织专用)、protease inhibitor cocktail set IV(酵母及真菌专用)、Protease inhibitor cocktail set V, EDTA-free(哺乳动物细胞和组织专用广谱丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、Protease inhibitor cocktail set VI(植物专用)和Protease inhibitor cocktail set VII(His融合蛋白纯化专用 )。种类繁多,合适于有不同要求的实验人员。

除此之外,G Biosciences的ProteCEASE™ Protease Inhibitor Cocktails包含了各种经过浓度优化后的蛋白酶抑制剂,具有良好的抑制广泛物种蛋白纯化中的蛋白酶活性的作用。ProteCEASE已经发展成为大规模制备型,具有50ml和100ml的裂解缓冲液中使用的两种规格。ProteCEASE分含有EDTA型,用于抑制金属蛋白酶(metalloprotease);和不含有EDTA型,用于维持依赖于二价阳离子的蛋白的活性。EDTA-free ProteCEASE型不会影响使用固相亲和层析的蛋白纯化,这种方便的形式具有强烈的蛋白抑制作用。

AppliChem GmbH的AEBSF hydrochloride BioChemica通过磺酰化蛋白酶活性中心的一个基团,不可逆地抑制凝血酶thrombin和其他一些丝氨酸蛋白酶(chymotrypsin, kallikrein, plasmin, proteinase K, trypsin)。这种试剂是PMSF和DFP的低毒替代品,具有较高的水溶性,溶液状态的pH为酸性,所以在这种pH下,稳定性较高。

除了蛋白酶抑制剂以外,在许多研究过程中,尤其是一些制药公司和研究院在研究药理学机制的时候,需要了解蛋白磷酸化途径,因此一个重要的步骤就是准确的观察一般和特异的磷酸化状态,所以蛋白抽提的另一个重要保护过程就是对磷酸化状态的有效保护。

磷酸化的蛋白可以被非特异性的磷酸酶(例如:碱性磷酸酶),特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或双重特异性磷酸酶去磷酸化。针对这种情况罗氏也推出了一种PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合片(可以与complete蛋白酶抑制剂兼容),这是一种即用型的片剂,其中的一些磷酸酶抑制剂只需要纳摩尔级的量。无需花费漫长的时间寻找合适的磷酸酶,也不必繁琐的称量和混合。PhosSTOP可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶,及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP1, PP2A, PP2B)和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。

而且PhosSTOP可应用于多种细胞提取物中磷酸酶的抑制作用,包括对酸性和碱性磷酸酶,丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP1, PP2A, PP2B)和酪氨酸蛋白磷酸酶的抑制作用。除了有效抑制目的蛋白的去磷酸化,PhosSTOP也不会影响后继的蛋白检测(例如:western blot)或是蛋白浓度检测 (例如:BCA或是Bradford)。

当然提到磷酸酶抑制剂或者蛋白酶抑制剂,一个业内公认的做得相对不错的就是默克了,它的磷酸酶抑制剂混合物是以DMSO贮存液的形式,摆脱繁琐的操作步骤,节约成本和时间,在效果方法能有效抑制剂蛋白样本中的各种磷酸酶(酸性/碱性磷酸酶、丝/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸等),配方完全公开,便于研究人员灵活应用。

旗下产品包括:可抑制酸性磷酸酶、碱性磷酸酶及酪氨酸磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II,可抑制丝/苏氨酸磷酸酶及酪氨酸磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set III,以及可抑制丝/苏氨酸磷酸酶及碱性磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set IV。

总而言之,在实验中适当的选择一些经过严格的质量监控的产品,想来相比较于家制的鸡尾酒而言具有更好的使用重复性,和有效性,让我们在下游应用中得到更洁净和清晰的结果。

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