蛋白技术篇之蛋白样品制备[选购宝典]

【字体: 时间:2008年01月07日 来源:生物通

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 生物通技术盛宴7:蛋白样品浓缩沉淀法宝
 生物技术盛宴6:蛋白纯化层析柱
 2007技术盛宴5:蛋白样品制备中各类杂质/杂蛋白的去除
 生物通技术盛宴4:蛋白酶抑制剂的选择
 生物通技术盛宴3:磷酸化蛋白和糖基化蛋白的样本制备
 生物通技术盛宴2:蛋白样本制备产品大PK
 蛋白技术篇之蛋白样品制备


一、“头盘”蛋白技术篇

1. 蛋白技术篇之蛋白样品制备

开篇之际,首先来看看这两句话:
“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的实验中弥补回来的”,
“让我们把蛋白质看作是具有独特而奇妙性质的实体”。

蛋白样品制备是许多实验重要的第一步,蛋白样品由于其结构特性各异,又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰,所以不可能有一个通用的技术,只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意:在研究蛋白的过程中,既需要严谨的技术流程,规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性,也需要将其看成是独特而奇妙的个体,结合以往经验但又不拘泥于经验,才能真正揭开她神秘的面纱。2007年年底让我们一起来回顾一下这一重要技术及值得关注的产品。


为什么要进行样品制备

“为什么要进行样品制备?电泳的目的不就是分离吗?”刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。这个问题很好回答,这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot),而样品中的蛋白种类可达到10万种以上,因此样品的预分离制备是必须的。另外比如像对临床组织样本进行研究,寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的,由于临床样本都是各种细胞或组织混杂,而且状态不一,如肿瘤组织中,发生癌变的往往是上皮类细胞,而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较,实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较,而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型,因此需要进行有效的样品制备。

但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢?这不仅仅是由于蛋白本身不同,所以需要不同方法来配合,而且在制备样品的时候,首先需要明确的是什么是实验的最终目的:是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白,这些直接决定了你的制备方法,也决定了实验的成功与否。由于想要分离的蛋白必须是完全溶解的,溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成,因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣,可采取预分离的方法,如欲分析的蛋白来自细胞器(细胞核、线粒体和原生质膜),则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白;如果是希望分离出尽可能多的蛋白,比如进行全蛋白质组分析,则可以将细胞或组织中的蛋白分成几部分,分级制备。

ebiotips:样品制备的原则:

  1. 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。

  2. 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。

  3. 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。

  4. 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

  5. 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。

以上这五项原则是根据北大人类疾病研究中心讲座内容改编而来,基本上可以说是囊括了样品制备过程中的抽象注意事项,之后还会提到具体的注意事项。



样品制备流程

蛋白样品制备过程简而言之就是三步:破碎、沉淀蛋白和去除杂质。虽然说出来不过寥寥的十个字,但是这几个过程经过这么多年,恐怕还没有那位研究人员可以说自己已经完全掌握,面对任何蛋白制备手到擒来。

破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则

样品制备的第一步当然是细胞或者其它样品的破碎,这一步看似简单,但是操作中一旦方法不当,就有可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。要想毫发无损的通过这一关,首先就要分析样品的来源,是易碎的细胞还是坚硬的组织?是植物细胞还是真菌?要做到有的放矢,才能事半功倍。

破碎的方法有许多种,包括循环冻融法、渗透法、去污剂法、酶裂解法、超声波法、高压法、液氮研磨法、机械匀浆法和玻璃珠破碎法等(可以归纳为机械法、化学法和物理法),这些方法有不同的应用范围,基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解变性,这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在(详细可参考生物通新技术专栏文章蛋白质组研究第一步:双向电泳蛋白样品制备-蛋白双向电泳样品制备-生物通)。抑制蛋白酶降解,减少操作过程温度或者其他物理化学条件对蛋白质变性的影响,减少核酸污染对后继电泳等分析的污染,都是破碎过程需要考虑的问题。

目标简言之“三高”,保留活性高,回收产量高,工作效率高。“三高”是苦中作乐的说法,说的轻松,这头一条“保留活性高”便是蛋白样品制备的痛中之痛----样品制备过程导致的蛋白变性和随后的复性工作是很令人头痛的问题。这两年来Merck,Qiagen,Roche,GE等公司纷纷开发了一些列蛋白抽提试剂,大大简化了样品制备工作的烦恼,更重要的是保证实验结果的可重复性。

Buster一家4口

大肠杆菌是最常用的外源蛋白表达工具。没有活性的包涵体形式表达产物往往用超声波或者压力破碎,包涵体变性和复性的过程之复杂困难效率之低,想起来都令人心碎。如果产物是可溶的活性蛋白,却并不适合用激烈的物理手段。超烦琐冻融法,那是需要精力很旺盛的。若要节省点精力,默克旗下Novagen的BugBuster蛋白抽提试剂就是为此而设的,优点包括:从E. coli 中快速抽提可溶蛋白,条件温和,不需超声破碎或高压破碎等机械手段,尤其利于活性蛋白提取;非离子型去垢剂,破碎细胞壁细胞膜的同时不会引起可溶蛋白变性;与后继亲和纯化步骤兼容。操作简便快捷直接可用,抽提步骤清晰简明。很符合“三高”的理念要求。以下是一些值得注意的地方:

ebiotips::

  • rLysozyme有助于彻底消化Ecoli细胞壁,得到更好的抽提效果——在制备较大的蛋白时尤其推荐使用,但不是必要的。在pLysS等有表达T7融菌酶的菌株中更加不必使用。

  • Benzonase 核酸酶可降解核酸,有效降低混合液的粘度,对后继离心和纯化都有帮助,更有助于减少2D电泳的斑点背景,强烈推荐共同使用。

  • BugBuster可分为原液,无氨基酸型原液,10X浓缩液,Master Mix(预加2种酶的即用型),和分别配合两种不同酶的配套试剂,原液价格是926/100ml,可以处理2—2.5升细菌培养液(每5ml可处理1克沉淀的湿菌体,相当于100—125ml左右的细菌培养液)。由于非常有效地减少样品浪费的消耗,通常已经足够满足实验需要。

  • Primary amine-free无氨基酸型原液主要针对的是后继实验准备做蛋白质固定化,交联等对氨基酸敏感的实验,用PIPPS代替Tris。10x浓缩液本来更划算一些,10ml/800左右(还没算折扣),可用自己想要的缓冲液稀释成100ml即用型原液。BugBuster可兼容Tris、PIPPS或者PBS体系,不过不适合用过酸性(〈pH5)或者NaCl浓度高于1M的溶液稀释,碱性溶液则OK。是否需要另外加酶或者要加哪种酶看自己需要了。

  • Master Mix(预加2种酶的即用型)无需稀释即可使用,另外还有Lysonase,单纯是两种酶的混合液,适合各种需要。

  • BugBuster在使用过程中可以加入EDTA、DTT或者二硫苏糖醇、0.5 M THP [Tris(hydroxypropyl)phosphine]等还原剂,不过要注意EDTA会影响后继HisTag亲和纯化,而还原剂可能会激活蛋白酶。

  • BugBuster在使用过程中可以加入各种蛋白酶抑制剂,不过也要注意,如果后继实验中融合蛋白需要用Thrombin, Factor Xa, 或者Enterokinase进行切割,避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。

  • 纯化的包含体可以用变性剂处理,直接上一些可耐受变性剂的亲和纯化柱,还可以用Novagen的 Protein Refolding Kit (Cat. No. 70123-3)中的溶解缓冲液处理,更简便的变性和复性。

YeastBuster    酵母表达一般可以选择分泌表达,使得表达产物游离到培养液中,不单减少产物积累,也有利于纯化。不过分泌表达并不总是可行的,特别是对于其他丝状真菌乃至植物细胞,往往需要破壁处理。酵母的细胞壁不同于Ecoli,通常可用蜗牛酶或者β-1,3-glucanase进行数小时消化破壁得到原生质体。(蜗牛酶记得在上海生化所的试剂公司有售,很便宜,貌似在枫林路上,叫西巴斯,应该是上海生化所的英文缩写的中文读法,寒,很多人问这个,生物通编者按)。YeastBuster则是采用还原条件下的去垢剂破壁,效率要高得多——只要室温15-20分钟(部分酵母要处理长一点时间,比如S.pombe)。同样,5ml的YeastBuster可处理1克湿重的酵母菌体,加入THP,推荐添加Benzonase核酸酶降低溶液粘度。15-20分钟后离心除去不溶细胞碎片,得到的上清就可以用于后继的纯化实验,很方便。经过处理的粗提物蛋白产量大,活性保持高,符合三高的要求。对其他丝状真菌乃至植物细胞YeastBuster同样可以大显身手。要注意处理过程是在还原条件下进行的,如果不适用还原条件就不能用这个Kit了。其优点和注意事项和上面介绍的差不多。反正温和快速高效就是最大的卖点。植物细胞也可以处理!

CytoBuster    在研究信号传导中激酶或者磷酸化酶,或者是研究细胞因子,或者要做免疫沉淀时,往往需要得到有活性的蛋白质,选择合适的裂解液就很重要,特别是哺乳动物细胞样品来源有限时。CytoBuster同样也含一种格外温和的非离子型去垢剂,操作上就更为简单,1.对悬浮细胞:只要离心收细胞,加入CytoBuster 5分钟;或者2.对贴壁细胞:除去贴壁细胞的培养基(如果有干扰后继蛋白质分析的成分,比如酚红就要用PBS或者HBSS多洗涤一次)加入CytoBuster 5分钟后用细胞刮子将细胞刮下集中到CytoBuster溶液中并收集到离心管里;最后离心取上清即可进行下步分析。不需要反复冻融,也不需要超声波,对绝大多数哺乳动物细胞有极好的溶解效果,温和非变性的细胞破碎条件对目的蛋白无害,抽提蛋白活性保持好,非常方便。这个试剂能与蛋白酶抑制剂、磷酸化酶抑制剂或者激酶抑制剂共同使用。50ml CytoBuster 裂解液价格在790左右(公开报价),用量呢?106 个悬浮细胞用量150ul,而6孔板/35mm皿用量为300ul左右,100mm培养皿用1ml左右。

NucBuster    除了CytoBuster,新的NucBuster是专门为哺乳动物细胞核蛋白抽提做的——在EMSA(/gel Shift)一类研究细胞转录因子的实验中需要用到细胞核蛋白抽提物以研究细胞因子和DNA的结合,过去细胞核蛋白抽提是件挺复杂的事,需要耗时7小时之久。NucBuster可将整个过程缩短为30分钟,先裂解细胞膜,去掉上清(细胞质成分),洗涤干净得到的细胞核沉淀再做下一步裂解。整个过程清晰简洁。2700多人民币可以做100次细胞核蛋白抽提,每次不到30元——要知道买一个核蛋白抽提物可都得要1000多(SantaCruz的就要1700大元)呢!经常做EMSA的实在值得考虑。


N合一的蛋白质样品纯化:一步到位最省心

一年又过去的了,套用某友的话,人老得很快,工作进展得很慢啊。难怪,N合一的产品最得人心,手机MP3MP4卫星定位导航,能有的全都给装上,一步到位嘛。如果你的目的是研究蛋白质特性,把时间都耗在纯化过程中那太费时间,看准目标,蛋白纯化也可以连同初步纯化一步到位。这类试剂盒通常在裂解细胞的同时利用某些共性初步分离蛋白质,令产品分段收集,使得在后继的电泳分析中减少背景蛋白的复杂程度,提高蛋白电泳分辨率。

ProteoExtract大宅门

Merck ProteoExtract,这一系列的产品不仅仅的细胞破碎,也包含了初步分组纯化的功能。包括全蛋白质组抽提试剂盒、分部蛋白质组抽提试剂盒、亚细胞蛋白质组抽提试剂盒、天然膜蛋白抽提试剂盒、胞质/线粒体分离试剂盒、组织解离试剂盒等等等等。比Buster一家4口更加适合精确的、规模不大的研究分析用途。

全蛋白质组抽提试剂盒(Complete)能在一支离心管中完成全蛋白质组的抽提,操作简单,无需超高速离心,无需超声或沉淀,也无需在较高温度下孵育样品,即可得到得到高品质的总蛋白。提高细胞蛋白的溶解度,同时有效去除核酸干扰,提高蛋白分辨率,产物无需浓缩,可直接用于2D电泳或者Western Blot、Elisa等分析,简单操作可可平行处理多个样本。内含Benzonase核酸酶可降解核酸,有效降低混合液的粘度,更有助于减少2D电泳背景拖尾,令蛋白质点更清晰锐利。

蛋白质种类千变万化,为适应不同需求,ProteoExtract™既有全蛋白质组抽提,也有分部蛋白质组抽提试剂盒(Partial)----按蛋白质溶解度不同,分部抽提蛋白,得到四个不同溶解度组份(易溶,中等可溶,部分难溶和不溶组分,酵母为三个)。整个操作过程无需超高速离心,也无需在较高温度下孵育样本。温和的反应条件确保最大限度地保存蛋白活性,并有利于提高低丰度蛋白分辨率。得到的蛋白可直接用于2D电泳等多种电泳分析以及Western Blot、Elisa等分析。试剂盒提供了分部蛋白抽提所需的所有试剂,包括抽提及洗脱缓冲液、蛋白酶抑制剂、Benzonase非特异性核酸酶等。每个试剂盒可用于20样本处理。可同时平行处理多个样品。

按照蛋白质溶解度分离蛋白还未算特别,ProteoExtract™ 亚细胞蛋白质组抽提试剂盒专门用于从哺乳动物细胞和组织中快速高效地按亚细胞结构分离蛋白,可从一个哺乳动物样本中分四步按亚细胞膜结构分别分离胞浆蛋白、膜/细胞器蛋白、核蛋白及细胞骨架蛋白。贴壁细胞可直接在培养皿上开始操作,逐步加入相应的试剂分步洗脱目标组分。而组织块则需要先经过细胞分离步骤。悬浮细胞操作更简单。整个操作过程无需超高速离心,也无需在较高温度下孵育样本。温和的反应条件确保最大限度地保存蛋白活性和后继的功能分析实验。按照目标蛋白的亚细胞定位初步分离,有助于避免其他同类蛋白的干扰,得到更高的蛋白分辨率,这对于许多实验人员来说省去了不少的麻烦。该系列还有一个试剂盒是用来分离胞浆蛋白和线粒体的,特别适合线粒体研究分析。

ProteoExtract天然膜蛋白抽提试剂盒专门用于从哺乳动物细胞和组织中快速高效地分离天然膜蛋白,仅需1至1.5小时即可3-5倍富集得到有活性的天然膜蛋白,两步操作无需超高速离心,可平行处理多个样本,主要从哺乳动物样本的细胞膜结构中分离膜蛋白,而不仅仅是根据蛋白的疏水性这一特性来完成膜蛋白的分离。极为温和的反应条件可以让膜蛋白及膜相关蛋白在其自然状态下被完整地分离出来,产物可直接用于酶活分析(包括激酶活性分析);膜蛋白翻译后修饰分析(磷酸化等),(非变性)胶电泳、免疫印迹及分析,膜蛋白的芯片检测等等。试剂盒提供了膜蛋白抽提所需的所有试剂,包括抽提及洗脱缓冲液、蛋白酶抑制剂等。每个试剂盒可用于20次贴壁细胞、悬浮细胞及组织等样本(2-5X106个细胞或25-50mg组织每个样本)处理。

特殊的磷酸化蛋白处理

细胞内信号通路失调往往是引起癌变或者肿瘤发生的成因,其特征之一是信号通路成员蛋白质的可逆磷酸化。因此研究细胞信号通路各关键分子的磷酸化水平是分析细胞内信号传导的研究重点之一。要从芸芸众生中专门发掘磷酸化蛋白,你可能需要ProteoExtract Phosphopeptide Capture Kit。其原理是利用固定化在磁性颗粒表面的锆离子与磷酸基团的特异性相互作用,可从复杂的蛋白样品中特异性并定量地分离磷酸化多肽,可用于磷酸化位点鉴定的激酶反应后的产物,用于LC-MS或MALDI-MS鉴定。从胰酶降解样本中仅需30分钟即可分离出磷酸化多肽组分,固相分离,无需脱盐,适用于不同量的样本,可谓高效、高特异、高重复性。试剂盒提供磷酸化多肽捕获所需的所有试剂,包括锆交换的磁性颗粒、即用型缓冲液等。每个试剂盒可用于100次反应,每次反应可从胶条酶解或分离的蛋白样本中得到多达2.5nmol磷酸化多肽。

Phosphoprotein Enrichment Kit则是另外一种快捷的富集磷酸化蛋白质的工具,富集后的蛋白可用于SDS-PAGE。试剂盒提供了磷酸化蛋白富集所需的所有试剂,包括裂解液、预装柱、洗脱缓冲液、洗提缓冲液、SDS-PAGE上样缓冲液等。每个试剂盒可用于处理25G哺乳动物组织或100*107个培养细胞,每个试剂盒提供两根预装柱,每根预装柱每次抽提的载量高达20mg磷酸化的卵清白蛋白,处理得当的话,柱子可以重复使用1至2次。可用于从25G哺乳动物组织或100*107个培养细胞中富集磷酸化蛋白。从细胞裂解开始仅需90分钟。

ProteoEnrich™ ATP-Binders™ 试剂盒则是专门用于如蛋白激酶或者其他ATP结合蛋白的抽提富集。试剂盒含聚丙稀酰胺树脂,系列结合、漂洗、洗脱缓冲液,DTT,蛋白酶抑制剂混合物等,方便快速进行粗裂解物中ATP结合蛋白的抽提富集,并能保持酶活性。每个试剂盒可用于处理17.5 mg粗提蛋白。纯化产物可用于2D电泳、SDS-PAGE、串联质谱、免疫印迹等实验。

蛋白样品制备过程可能导致磷酸酶释出或者其他因素而使目标蛋白的磷酸化状态改变,因此研究中就要特别注意中要防止蛋白质在样本制备过程中意外磷酸化。防止蛋白酶降解,地球人都知道。防止蛋白质磷酸化该如何呢?可在细胞破碎同时选择磷酸酶抑制剂混合试剂,根据目标蛋白可以选择碱性磷酸酶+丝/苏氨酸蛋白磷酸酶混合抑制剂;碱性磷酸酶+酸性磷酸酶+蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂混合物等等。这类抑制剂可用于组织或细胞蛋白抽提,不受去污剂影响。PhosphoSafe Extraction试剂其实质也就是含有磷酸酶抑制剂混合物的试剂,在从哺乳动物或昆虫细胞中抽提可溶性蛋白时有助于确保相关蛋白的磷酸化状态。产物可用于激酶分析、蛋白相互作用分析、免疫印迹等其他分析、BCA蛋白定量分析。

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