2007技术盛宴5:蛋白样品制备中各类杂质/杂蛋白的去除[选购宝典]

生物通编者按：2007年刚过，各种年终汇总琳琅满目，生物通网站也将于未来一个多月里大摆生物技术饕餮盛宴，为读者带来前沿技术和最新信息的思维享受和满足——每日密集精选各厂家及经销商过去一年在中国大陆地区着力推广的重点产品文章或者最新上市的新产品新技术文章，将2007年当中生物通网站倍受瞩目的产品和技术一一呈递，打造精彩纷呈的生物技术产品“视觉盛宴”：“头盘”蛋白技术篇、“汤菜”芯片服务篇章、“副菜”细胞技术篇、“主菜”仪器篇、“甜品”PCR技术篇及分子生物学篇等。品赏饕餮盛宴的每道精品之后，即将根据读者投票，公布“精彩生物通2007中国年度产品大奖”评选结果。   生物通技术盛宴4：蛋白酶抑制剂的选择

生物通技术盛宴3：磷酸化蛋白和糖基化蛋白的样本制备

生物通技术盛宴2：蛋白样本制备产品大PK

蛋白技术篇之蛋白样品制备

蛋白样本制备之二：去除杂质

蛋白样品制备中，在细胞破碎之后，既可以利用特定蛋白质的特性来分离某一类蛋白质，比如亲和纯化，比如生物通前面介绍的磷酸化蛋白富集，或者膜蛋白富集；另外一个考虑方向是去除杂质----去掉样品中某些非目标高丰度蛋白或者杂质的干扰，同样可以达到简化样本的目的。当然要小心“倒洗脚水的时候别把婴儿也倒掉了”，一定要选择可靠的产品。

比如，潜在疾病标志物的最好样本来源就是血清或其他体液，此类样本可以提供人蛋白质组中绝大部分组份。然而用蛋白质组分析方法鉴定疾病标志物最大的挑战来自于血清中大量的高丰度蛋白对检测的干扰，血清中有大约55%的蛋白为白蛋白，而IgG大约占血清中蛋白总量的10-25%，这些高丰度蛋白的存在会增加低丰度蛋白检测的难度，去除占血清总蛋白近75%的白蛋白和IgG将有助于更好地鉴定其他的蛋白。MERCK的ProteoExtract™ Albumin Removal Kit(￥3219/12tests)，基于一种特殊的亲和树脂，可高度特异性地与白蛋白结合，从而快速、高度特异性地除去体液（血浆、血清或脑脊液）中的白蛋白，另外一种Albumin/IgG Removal Kit(￥3734/12tests)的纯化柱树脂包含白蛋白结合树脂和免疫球蛋白A结合树脂，基于两种目的蛋白的洗脱条件不同，可以分别洗下80％以上的白蛋白和IgG，生物通编者注，重复性好，可显著降低样品复杂性，利于检测样品中的低丰度蛋白。被除去的血清白蛋白和IgG占其总蛋白的75％，从而使得剩余的样品可以浓缩3-4倍上样，用于SDS-PAGE凝胶电泳、2D凝胶电泳或液相色谱分离。每个试剂盒提供12支一次性使用的重力自流式预装柱，每个柱子可处理20-60ul血清或体液样本，吸附量高达2mg白蛋白，可除去人血浆中80％以上的白蛋白，经免疫印迹和LC-MS捕获蛋白分析（结果未显示）验证该树脂对其他血清、血浆蛋白的非特异性结合很低，处理后的样品中保留了90％以上的其他标志蛋白如Transferrin、Factor VII和Antithrombin III。试剂盒针对人血清样本作了特别优化，但使用同样的操作步骤也适用于兔、大鼠或小鼠血清/血浆样品中白蛋白的去除。如果需要处理样本量大还可以选择Maxi规格的，每次可处理血清/体液量为60/180ul。

Qiagen的Qproteome Albumin/IgG Depletion Kit（￥2690/6tests）则是利用固定化单克隆抗体来特异吸附样本中的Albumin/IgG，吸附更加专一高效，25ul人血清或血浆过柱即可得到0.5-0.8mg不含白蛋白与IgG的血清或血浆蛋白，实验非常方便。从图片可以看出，去除白蛋白和IgG后的样本电泳结果分辨率明显改善。Q还有专门去除鼠类Albumin的试剂盒，也有可对付每次150ul血浆的较大规格的去除白蛋白or/and IgG的过滤柱。

（2D-PAGE蛋白胶显示没有去除白蛋白（左图）和去除白蛋白（右图）血浆样品比较）

去垢剂如SDS、Tween、Tritonde等是蛋白样品处理过程中常常用的组分。请神容易送神难。要除掉这些去垢剂？Calbiochem推出的CALBIOSORB™吸附剂专门设计用来除于蛋白或其他生物样本中所含有的去污剂，对不同类型的去污剂，如阳离子型、阴离子型、双性离子型及非离子型的去污剂，均有非常好的去除作用。
ebiotips:最佳吸附剂用量计算方法：吸附剂量＝去污剂mg数*2.5/相应结合能力

去 污 剂	类 型	结合能力 （mg去污剂/ml吸附剂）
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)	阳离子型	120
CHAPS	两性离子型	110
Cholic Acid Sodium Salt	阴离子型	73
n-Decyl-β-D-glucopyranoside	非离子型	169
n-Dodecyl-β-D-maltoside	非离子型	66
Dodecyl Sodium Sulfate (SDS)	阴离子型	94
n-Hexyl-β-D-glucopyranoside	非离子型	78
Lauryldimethylamine Oxide	两性离子型	66
n-Octyl-β-D-glucopyranoside	非离子型	132
n-Tetradecyl-β-D-maltoside	非离子型	161
TRITON® X-100 Detergent	非离子型	157
TWEEN® 20 PROTEIN GRADE® Detergent	非离子型	122

    Calbiochem的Detergent-Out™系列去污剂去除试剂盒使用上比填料简单，使用简单的柱式离心方法高效去除蛋白样本中的去污剂。Detergent-Out™ SDS removal Kit和Detergent-Out™ Detergent removal kit提供MINI及MIDI两种包装，其中MINI可用于2-3mg去污剂的去除，而MIDI可用于10-15mg去污剂的去除。不过，注意某些疏水性蛋白可能这2产品中的树脂吸附，一般来说蛋白回收率可以达到95%以上。怕？那还可以选择OrgoSol™-Detergent-Out™ Detergent Removal Kit，这个以沉淀的方法去除蛋白样本（包括疏水性蛋白样本）中离子及非离子型去污剂，其蛋白回收率几乎可以达到100%，沉淀后的蛋白可以不同的缓冲体系重新溶解，不过对于沉淀易失活的蛋白样本，不推荐使用。同样提供MINI和MIDI两种包装，MINI可用于10ML的蛋白溶液的处理，而MIDI可用于30ML的蛋白溶液的处理。
 

Tag蛋白的纯化和去除

带有融合标签的表达产物----融合蛋白的纯化通常也是紧接细胞破碎工作进行的。设计融合标签的主要目的之一就是为了方便后继的亲和纯化。目前最为流行的融合标签自然是His-Tag，和GST，来自GE Healthcare（原安玛西亚）、Qiagen，Novogen，Sigma等公司都有质量非常稳定可靠的产品，种类还特别丰富，分别对应不同的上样量和工作压力和流速的需要。在过去的一年中价格也不时折来折去，常来生物通的读者们想来都无比熟悉了。在这里就不特别介绍。其他Tag都有各自厂家标配的纯化介质。在过去一年中貌似没有非常特别值得大书特书的新品，如果有提醒我补充一下。

融合蛋白纯化后，虽说有的Tag如HisTag很小，可以不用去除。可有的情况下，还是要去除Tag的。去除Tag的方法无非是利用融合蛋白设计的蛋白酶切位点，比如Xa因子，肠激酶，凝血酶等等切除。忍不住唠叨一下，这些蛋白酶识别位点虽然比较专一，但是酶切效率也和目标蛋白构象有关，浓度过高还是有可能导致非目标切割的，因此无论如何实验前需要用不同浓度和反应时间做预实验摸条件的，PAGE检测酶切效果后再放大实验。至于Xa因子，肠激酶，凝血酶哪个好用，首先是要看你的目标蛋白里有没有类似的酶切位点，有的就不能用。New England Biolabs还有一个利用pH或者还原条件裂解去除Tag的。这些都不必多说，生物通早就介绍N次了，大家比生物通更熟悉。切下来的Tag再过一下亲和柱就可以去掉，问题是蛋白酶切引入的那一点点蛋白酶呢？所以你一定要买经过修饰的蛋白酶，以便后继实验中的去除。生物通在这里简单介绍几个包含蛋白酶和后继去除的试剂盒，目的就是为你省点事......

Novagen凝血酶切割/清除试剂盒，包括50Units生物素化凝血酶，以及固定化链亲和素以便酶切完成后去除生物素化凝血酶（￥3701+0.8ml纯化琼脂糖+10个过滤柱，1Unit=16小时消化1mg对照蛋白的量）。共价结合生物素的凝血酶特异性切割带有识别位点（LerValProArg/GlySer）的目标蛋白，不含有任何杂蛋白酶；可在酶切反应结束后，通过固定化链亲和素方便地去除蛋白酶。使用方法与未修饰凝血酶相同，与链亲和素琼脂糖的结合率大于99%。此外提供对照蛋白用于实验样品平行的对照消化，或测试特定条件下的切割效果。48kDa对照蛋白被切割成35和13kDa的两个片段，可通过标准SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测。这样就不用苦恼于“到底酶是否切动了呢”这样的问题了。Thrombin的效率相对是高的，和目标蛋白比例以1:2000为好，所以1个单位切割1mg蛋白来计算的。

肠激酶切割/清除试剂盒包含50Units重组肠激酶(rEK)，及EKapture™ 琼脂糖以便酶切后去除肠激酶（￥3398/50Units+1.5ml纯化琼脂糖+10个过滤柱，1Unit=16小时消化50ug对照蛋白的量）。rEK是牛肠激酶催化亚基的高纯品，识别切割位点与天然酶相同（AspAspAspAspLys），切割速率更快。目标蛋白经酶切后，通过Ekapture琼脂糖亲和结合可从反应体系中去除99%以上的rEK ，并可通过离心过滤去除琼脂糖。由于酶切和亲和结合使用相同缓冲条件，因此操作中不需要变换缓冲液。试剂盒中还包括对照蛋白，用于实验样品平行的对照消化，或测试特定条件下的切割效果。48kDa的rEK对照蛋白被切割成32和16kDa的两个片段，可通过标准SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测。对照蛋白同时具有氨基末端S•TagTM序列，可用Western杂交精确检测16kDa蛋白裂解产物。

Xa因子切割/清除试剂盒包括400单位高纯Xa因子，及Xarrest™ 琼脂糖以便酶切后去除Xa因子（￥3140/400Units+5ml纯化琼脂糖+10个过滤柱；1Unit=16小时消化50ug对照蛋白的量）。Xa因子是从牛血浆分离并经过Russell蝰蛇蛇毒活化的高纯蛋白酶。产品中没有任何杂蛋白酶，因此不会产生二级切割。Xa因子的切割识别位点是IleGluGlyArg的羧基末端，因此可以从相应的重组蛋白中去除所有载体编码的序列。目标蛋白经酶切后，通过Xarrest琼脂糖亲和结合可从反应体系中去除99%以上的Xa因子，并可通过离心过滤去除琼脂糖。由于酶切和亲和结合使用相同缓冲条件，因此操作中不需要变换缓冲液。试剂盒中还包括对照蛋白，用于实验样品平行的对照消化，或测试特定条件下的切割效果。49kDa的 Xa对照蛋白被切割成32和17kDa的两个片段，可通过标准SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测。对照蛋白同时具有氨基末端S•TagTM序列，可用Western杂交精确检测17kDa蛋白裂解产物。

TAGZyme：45分钟 Vs.16小时的优势

Qiagen也有Xa因子的纯化试剂，5ml多谢1980元，配Buffer没配柱子。400UnitXa因子则定价2020元。原理相差无几，性价比没什么优势。Q家真正值得称赞的是TAGZyme系列，用DAPase而非传统蛋白酶的，只适用于N端带有Tag的融合蛋白。因为DAPase有点特别，是从N端开始每次2个氨基酸成对切除，直到碰到某几个终止位点氨基酸才停下来，比如Pro，或者奇数位的Lys，Arg，Glu，特别是这个奇数位的Glu----还可以用Qcyclase和pGAPase 处理后在最后彻底切除，虽然有点曲折，最终可以得到100%天然蛋白，不带任何多余的氨基酸。这种切割模式很大程度减少的非特异的切割，对于蛋白质内部包含凝血酶之类的蛋白酶切位点的蛋白质来说，更加是首选。DAPase效率超高，只要45分钟就可以完成整个切割过程，对于饱受凝血酶等“慢性子”的蛋白酶折磨的人来说，DAPase真是太幸福了。就算是还要用Qcyclase和pGAPase 彻底处理掉多余的Glu也不过2小时完全搞定。虽然Q家的DAPase卖得很贵，2.5Unit就要3820元（生 物通小编说:你没看错也，就2个单位半，吓一跳吧），不过却足够消化50mg的蛋白质了----其实就产出而言性价比也不亚于凝血酶了。DAPase，Qcyclase和pGAPase这一系列的蛋白酶都自带HisTag，不需要特殊的纯化介质，只要将酶切产物过His Tag的亲和纯化柱就可以一次过去除Tag和这些蛋白酶了，Q的东西有时真贴心，赞！不过这个玩意儿本来用不着特别纯化填料也就不属于蛋白样品制备的，信马由缰不知怎么的就扯远了。就此打住（生物通，版权所有谢绝转摘）

生物通技术盛宴7:蛋白样品浓缩沉淀法宝

生物技术盛宴6：蛋白纯化层析柱

2007技术盛宴5:蛋白样品制备中各类杂质/杂蛋白的去除

生物通技术盛宴4：蛋白酶抑制剂的选择

生物通技术盛宴3：磷酸化蛋白和糖基化蛋白的样本制备

生物通技术盛宴2：蛋白样本制备产品大PK

蛋白技术篇之蛋白样品制备