胶回收方法之选全攻略[选购宝典]

【字体: 时间:2006年07月17日 来源:生物通

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    生物通技术专题:说到电泳凝胶的片断回收,想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实,一般在各个和分子生物学沾到一点边儿的实验室里,从琼脂糖凝胶中回收DNA,仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳片断回收没有1—2个小时是搞不定的,每个实验室也有自己的独门秘诀,可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途,不同价钱的快速凝胶回收试剂盒,一下子将胶回收的时间缩短到10多分钟,操作也大大简化,胶回收就变成“小菜一碟”了。

    然而,从bbs逛上一圈下来,发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单的操作而烦恼。到底是什么导致了实验新手,甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验——比如酶切连接、转化筛选、测序或者PCR扩增、标记乃至显微注射等等,生物通编者为大家搜罗各种产品和方法的优缺点,注意事项,做一个胶回收全攻略篇。

一、胶回收的关键参数

    胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收,无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂,最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度),回收效率,操作方便(速度),柱子的载量等等。

回收产物质量:回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中,普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖,会连同DNA一起从凝胶中抽提出来,会强烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断,产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收,质量还包括了产物的完整与否,如果机械剪切力使得回收产物大小不一致,后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收,质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小,对后继实验同样也有影响,比如连接、标记实验等等就很不爽,往往不得不再浓缩一次,增加了操作的复杂性。此外,极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。

回收率:回收得率,是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少,电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失,因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断,提高产物得率,对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关,比如DNA片断越大,和固相基质的结合力越强,就越难洗脱,回收率就低;又比如说,DNA的量越少,相对损失越大,回收率越低。因此,根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是,由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响,所以回收率并非是一成不变的。

其他:操作方面,相信大家都会比较喜欢操作简单,快速,应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂,可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量,就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了,因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质,过量的产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物,大载量就很有优势——同一个片断你要用2个柱子,多郁闷啊。(转下页)
  ·胶回收方法全攻略(2)
  ·胶回收方法全攻略(3)
  ·胶回收之选全攻略(4)
  ·胶回收之选全攻略(5) 
  ·胶回收之选全攻略(6:大片断的难题)
  ·胶回收之选全攻略(7)

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