胶回收之选全攻略(6:大片断的难题)[选购宝典]

【字体: 时间:2006年07月18日 来源:生物通

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    续前:大片段级:指的是片段大小超过10kb的DNA片断,由于越长的DNA分子和纯化膜的结合力越强,洗脱力越差,在离心过柱时可能被“扯断”,因此常规的离心过柱的方法并不适合对付这些大家伙。在凝胶电泳的大片断回收,特别是几十kb的大片断,经典方法是生物通前文提到的电洗脱。此外,低熔点琼脂糖和琼脂糖酶消化也是常常有人选用的方法,新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料,生物通在此一并介绍。其实无论用什么方法,在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片断,操作时一定要小心注意,粗暴的操作,最后结果也是自己来承受的。

    这些方法中,速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟,谁愿意为一个小小的胶回收浪费2个多小时呢?有那功夫干点别的不好?我最早用的其实是当时的Pharmacia(后来改为Amersham,现在是GE Healthcare Life Sciences)的一个玻璃奶(Glassmilk)试剂盒。现在记得Glassmilk的人应该不多了,在当时却是我们眼中的神奇宝贝——半个多小时就可以完成本来要搞2个多小时的活:溶胶液溶胶后,加入10ul混匀的玻璃奶溶液,混匀静置吸附后,离心去上清,再清洗1—2次,干燥,最后用洗脱液洗脱,离心取上清即可。

1.QIAEX II

产地:Qiagen
回收范围:40bp-50kb
推荐指数:
价格指数:(150次反应2,106,500包装4,860,约14元/反应,半价活动开始以来,这个试剂盒的性价比就很高啦)

特点:

  • 通用性高:一般或者低熔点琼脂糖凝胶,TAE或TBE,以及聚丙烯酰胺凝胶
  • 无NaI干扰后续实验
  • 大片段DNA保存较好,不会被剪切

使用心得:

    这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒,利用的是配合高离液盐(chaotropic salt)的silica-gel particles,因此QiaEX可以从盐,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,染料,蛋白以及核苷酸中无需苯酚抽提或者酒精沉淀即可获得纯化DNA片段。这个试剂盒使用方法和玻璃奶的试剂盒基本一样,区别在于玻璃奶是粉碎的玻璃,因此可能存在大小不一、边缘尖锐等情况,在离心力下,大小不同的碎片的沉降系数不同而导致在沉淀中分布位置不同,当长片断一头粘附在大片断一头吸附在小片断上,离心产生的剪切力就会导致长片断的断裂。而QiaEX的纯化填料是人工特制的大小均一的球形小珠(Beads),能更好的吸附DNA,也不易产生上述的剪切力问题,使得回收的大片断DNA更为完整。

    无论是玻璃奶还是纯化填料,比起过柱的方法,优点在于适用于较大范围的DNA回收,从小片断到超级大片断都可以,适用范围广;而且每次反应可以根据估算的待回收DNA的量来放大或者缩小纯化试剂的量,比较灵活。比如QIAEX说是150反应(每次5ug),实际上往往可以用200多次或者更多。

    但是这个方法的问题有2个,一个是比较麻烦,需要一定操作经验——无论是清洗或者是最后的洗脱,离心后要尽量多取上清而不干扰沉淀,多少有点点难度,特别是最后取洗脱的DNA,要舍得放弃最后那点上清,免得回收产物中混入了纯化介质,在后面的实验中得不偿失。所以,你可以从此想象,由于每次离心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的,去除始终不彻底,这就注定了这个方法纯化的产物纯度不如离心高,回收率也不如那么高。你看,QIAEX说这个回收产物可用于酶切、连接、标记和PCR,但是就没有提到显微注射芯片分析等更高要求的实验。另一个问题是干燥的程度如何把握需要一定经验——干过头了洗脱困难,没干透就会将酒精带入后继实验(有人向生物通投诉过纯化产物测OD得到非常奇怪的读数,过去一看操作,果然是没干透就洗脱的结果)——要干到沙面雪白而靠管壁的最边缘还有丁点透明就可以了。当然,这个现象描述起来不着边际,做过的人就心中了了。洗脱体积通常是20ul。操作要领除了前面提到的问题,就是离心充分,离心后取管子动作轻快,事前调好加样枪,取上清要轻,靠壁、放枪缓,动作利索,不要千万不要来回抽。舍得放弃。

QiaEX相关参数:

DNA size Recovery*

44 bp 75%
75 bp 75%
500 bp 95%
7.5 kb 85%
23.5 kb 75%
48.5 kb 60%
Binding capacity: 5 µg DNA per 10 µl QIAEX II suspension
Recovery: 60–95% of DNA fragments (40 bp – 50 kb)
Elution volume: Elution volume: 20 µl

    类似方法的产品还包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit

2 Agarose Gel DNA Extraction Kit
产地:Roche-Applied Science
回收范围:0.4kb—100kb(单核苷酸〉20bp)
推荐指数:
价格指数:(100次/1356,每次反应13元左右)

特点:

  • 标准的或低熔点琼脂糖回收都可
  • 可以用于克隆连接或者高特异性标记(基本标记或缺口平移primed labelling or nick translation)
  • 0.4kb—9.5kb范围内回收率为80%
  • 通用型试剂盒:大至100kbDNA片段到小到寡核苷酸都可以
  • 操作简单
  • 均匀统一的纯化介质珠,减少剪切力,无杂质(比如酶抑制剂),不会影响后续反应

使用心得:

    Roche的胶回收试剂盒原理也是一样的,可以完成几乎实验室有关DNA胶回收的所有需要,从基因组大片段DNA到单核苷酸,并且在回收率上也有出彩的表现:0.4-9.5kb,大约80%;10-100kb,大约60%;单核苷酸(>20碱基),大约65%

    其实,生物通前面提到的纯化介质的方法在使用中有一些操作的问题,其实改良起来也并不很困难。只要多提供一个单纯过滤离心柱,原来的问题看来应该不难解决——直接将混合有纯化介质的溶胶液加入柱子中过滤离心,吸附了DNA的纯化介质在膜上,上清彻底离心到管中,不就不用担心会悬浮沉淀、干沙等等问题了吗?其实Promega就有这样的解决方法,不过由于那试剂盒主要目的是纯化PCR产物或者酶切反应中的DNA,本身不带溶胶液,所以我们在这里就不具体介绍了。

    这种方法通常需时半小时左右,算是比较快速省事的。毕竟大片断的操作要格外小心。除了这种方法,生物通在这里再重复介绍一下其他的一些方法。

    1. 低熔点琼脂糖:如果你手头有Cambrex(原来的FMC,琼脂糖行业标准的制定者)的SeaPlaque GTG琼脂糖,那真是太幸福了。SeaPlaque是世界上第一个低熔点琼脂糖系列,Cambrex的GTG(遗传技术级别)级琼脂糖特别去除了抑制酶反应的各种杂质,可以在琼脂糖凝胶中进行各种酶切、连接、PCR、转化等等实验。所以,SeaPlaque GTG凝胶电泳后切下的条带就可以在65度融化(20-30度凝固),直接进行后继的酶切连接PCR等等的反应了,当然,前提是你的电泳槽和Buffer要足够干净,最好是专用的。这个反应条件实在是足够温和,当然不便宜,25克琼脂糖要1788大元!特别适合分辨200bp—25kb的片断。其实,也就是大小通用的方法。

    如果只是普通的低熔点琼脂糖也不要紧,切下来的胶块加入缓冲液65度融化后冷却到室温,可以直接用等体积酚抽,也可以用琼脂糖酶来消化。酚抽时注意不要剧烈振荡以免损伤大片断DNA,两相间的白色物质是琼脂糖,取上清酚氯仿抽提后乙醇沉淀。琼脂糖酶可以消化融化的琼脂糖为低聚糖,随后用酚氯仿抽提后用乙醇沉淀。New England Biolabs的这种酶50单位价格300多,每200mg 1%凝胶用一个单位酶,42度条件下反应。Takara的这种酶100单位260多,同样体积的凝胶要用2个单位,可以在60度反应,所以也可以用常规琼脂糖。只是常规琼脂糖在65度挺难融,很费时间。

    2. 电洗脱的原理是将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中,通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相,回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。电洗脱主要的麻烦是在透析带都比较大、两头要绑,没有刚性的袋子使用不方便,中间溶液体积大,膜面积大容易吸附产物。生物通在03年就有文章介绍以色列一家公司出品的GeBA产品,是在离心指管两边开窗贴上透析膜,这种管子可用于透析或者电洗脱,由于管子有刚性,内容体积固定,膜面积也很小,同时还提供电洗脱时放在电泳槽中的架子,操作起来十分方便,很大程度上解决了这个困扰。电洗脱条件温和,对琼脂糖没有特殊要求,同时还可以用于丙烯酰胺凝胶中的片断回收或者是蛋白质的回收。GeBA的产品基因有限公司有售,此外Merck旗下的Novagen也引进了类似的产品,价格相当。详细信息参考:从PAGE胶/琼脂糖凝胶中回收蛋白质/RNA/DNA的新工具

    3. 挖槽法。限于个人习惯的一些不入流的小技巧,有时应急(比如定的产品老不到货时)也可以对付一下。无非就是在条带前面挖坑,加入缓冲液,继续电泳半分钟,手提紫外观察,等条带全“下海”就把坑里的溶液都吸上来。大片断会遇到的问题通常是出胶慢,上对岸倒快,所以应对就要用2手,一个是在坑里缓冲液中加点什么让泳动速度降下来(低熔点琼脂糖就是其中一个方法),要不就在对岸堵上孔径特小的膜,等这边条带全部下水后反向电泳一下,让被膜阻挡的DNA回头,离开那膜。然后取溶液纯化DNA。这些方法通常在条带浓,回收率要求不高的时候可以应急,挺磨耐性的,平常还是用Kit的算了。这里提到的老方法,都要特别注意,切胶的刀要干净锋利,切口平滑,切得不整齐有时DNA出胶很慢,不知道为什么。我们这里写写,算是忆苦思甜好了。(转下页)

  ·胶回收之选全攻略(7)
 

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