胶回收之选全攻略(7)[选购宝典]

【字体: 时间:2006年07月18日 来源:生物通

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    胶回收之选全攻略(6:大片断的难题)

    讲完大片断,剩下就是小片断的回收了。小于100bp的片断通常在电泳时就比较难观察分辨,需要用分辨率很高的琼脂糖或者丙烯酰胺凝胶。比如Cambrex的NuSieve 3:1或者GTG,或者是大名鼎鼎的MetaPhor琼脂糖。所以实际上对于小片断,可以分为两种情况:一个是真的要回收电泳中特别小的片断,这种情况我们前面有提到,比如Qiagen MinElute系列可以回收70bp以上的片断;而QIAEX纯化介质可以回收40bp以上的小片断,可以根据情况选择,生物通在这里不再罗嗦了。另外一种情况是要去除一些小片断或者是核苷酸、标记物、或者是一些酶切碎片,或者去掉接头(Linker/Adeptor)或者什么的。其实这时已经不需要用电泳来分别,也就算不上胶回收的范围,不过既然提到了就顺手写写。

    PCR产物回收试剂盒实际上也是一种除去小片断的试剂盒,通常回收范围是100bp到10KB之间,也就是说将小于100bp(或者70bp)的引物或者引物二聚体连同其他杂质一同去除,操作简单,只需要将PCR产物加入过滤纯化柱中离心,清洗一次,洗脱就可以了,5分钟搞定,回收率高达95%。PCR后需要酶切时,以前常常为省略跑胶纯化的步骤,要在PCR产物中直接酶切,往往导致一些酶切问题,如今用这种PCR产物纯化试剂盒就不用电泳,5分钟OK了。用不着冒险直接酶切——万一酶切有问题多麻烦呀。通常同一个品牌的PCR产纯化试剂盒和胶回收试剂盒的柱子是同样的柱子,区别是胶回收试剂盒多一个溶胶液。所以,你可以用胶回收试剂盒做PCR产物纯化,溶胶液照加可也,调pH和盐浓度而已。

    如果需要纯化寡核苷酸或者引物,Qiagen的QIAquick Nucleotide Removal Kit是一个好选择。可以用于纯化17-40mer的寡核苷酸小分子,以及40bp-10kb的DNA。用于纯化标记反应是不错的选择,方法和PCR产物回收试剂盒是一样的,很方便。除了这种膜吸附的柱子,还有一种凝胶过滤原理的柱子也可以用于分段收集不同大小的产物,那个在建库等实验中用的比较多,也有用于纯化标记反应中的未标记分子或者核苷酸的。

    很小的DNA片断常常会用PAGE胶电泳。PAGE胶好像还没有很好的溶解方法,除了我们前面提到的电洗脱,Qiagen还提供一些私人方法,在应急的时候可以尝试。将切割下来的PAGE条带冲洗后加入指管中,加入2倍体积的分散缓冲液(0.5M醋酸胺、10mM的醋酸镁,1mM EDTA, 0.1%SDS,pH8.0)50度保温30分钟,离心取上清,避免混入碎胶,加入3倍体积的溶胶液,后面步骤一样。这样也可以回收PAGE胶里的片断。(生物通专稿 微安 张迪)

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