胶回收方法全攻略（3）[选购宝典]

胶回收方法全攻略(2)

胶回收方法之选全攻略

三、常规片断级的选择指南：所谓常规级，即回收片段大小介于100bp和10kb之间，在这个范畴内包含了一般的质粒或者克隆片段的回收。主流方法是柱回收试剂盒。

1. Qiaquick Gel Extraction Kit

品牌：Qiagen
回收范围：70bp-10kb
推荐指数：
价格指数：（50包装1,350，250包装6,372，约27元/反应，现有半价活动，价格非常可亲！）
特点：

• 高达80%回收率

• 操作快速简单，3步完成70bp-10kb片段的回收

• 提供三色指示剂的电泳上样loading  Buffer,方便判断和操作

• 回收产物纯度高，可用于同位素或荧光测序、芯片分析、连接转化、酶切、标记、PCR、显微注射、体外转录等后继实验

使用心得：

    Qiaquick最引以为傲的就是非常稳定的质量，高回收率和方便的步骤。产品质量的稳定可靠，一向是实验首要条件。毕竟，实验步骤是环环相扣的，每一步出现问题都会导致后患无穷，费时费力，还更费钱，对心情更是一种折磨。用试剂盒不就图省事和可靠吗？从核酸纯化领域起步的Qiagen，在全球实验室都享有极好的口碑，是值得信赖的选择。因为Qiagen有强大的研发队伍，精益求精优化实验操作的每一环节，绝非普通临摹制品、仿制品可比。以回收率为例，我们前面提到，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。所以Qiagen以严谨的态度提供多种条件下的详细介绍：

 

使用QIAquick回收之前和回收之后再混合的DNA片段 (大小已指出) 。对所有尺寸的片段均获得了接近80％的回收率。 A  1–5: 回收之前; P: 回收之后再混合。样品使用 1.5% 琼脂糖凝胶分析(TAE buffer)。 B  1–3: 回收之前; P: 回收之后混合。样品于 3.5% 高分辨琼脂糖凝胶上分析( TAE buffer)。M: pTZ-HinfI marker。

     记得《分子克隆II》里曾经说少于500ng的DNA几乎没有回收价值，看看上表就可以发现，现在的技术发展，即使是少到100ng的DNA还有70%的回收率呢！而且操作方法还很简单。

    虽然是几乎不需要实验技巧的简单操作，如果你注意到一些小技巧 还是很有帮助的。DNA回收纯度取决于纯化介质对DNA吸附的特异性、洗涤杂质是否彻底。而DNA回收率和浓度则与elution buffer的体积，以及buffer在柱子上停留的时间有关。较大的洗脱体积可以提高回收率，充分洗脱，但是会造成产物浓度太低不好用。比如100-200ul的洗脱液可以彻底洗脱纯化柱吸附的DNA，不过考虑到后继实验的方便，Qiaquick建议使用50ul的洗涤液，正对加入膜中央（避免加在管壁上而不能充分接触纯化介质），可以完全浸润回收柱上的纯化膜。最低建议采用30ul洗脱液，但是可能会降低回收率。有人试过用15—25ul洗脱2次，觉得这样第一次浓度高第二次比较充分，其实没有必要，只要适当延长在柱上停留的时间，就有助于提高得率——Qiagen的Protocol说明，30ul停留1分钟要比50ul停留1分钟回收浓度高1.7倍。充分离心（保证速度和时间）有助于提高得率和纯度，减少残留对后继实验的影响（这个方法要注意不是所有试剂盒都可以使用，因为有些试剂盒的纯化柱填料松一些，离心有时可能导致少量填料脱落，而Qiagen的这个产品是膜式的，结合非常牢固，据生物通线报，中大有人用这个柱子高温消毒后重复使用，效果不赖，可见皮实。当然这是厂家绝对不推荐的）。

    其他的技巧也是大家熟知的，比如切胶的时候要尽量减少切胶体积（不超过400mg），由于Qiaquick柱子的载量达到10ug，如果胶块实在太大而预期DNA总量不超过10ug，可以用大一点的管溶解，分几次上柱离心吸附后再洗涤。注意的是紫外照射时间不要太长，因为紫外线对DNA（特别是对于较大的片段）有影响。还有就是溶胶要彻底，用枪头把胶块弄碎一点有助于50度下快速溶解。溶解完全后溶液的颜色指示溶液的pH值，如果变色需要调pH值以防止实验失败。需要用ddH2O或者TE洗脱的，注意pH在7.0—8.5之间的回收率最高。回收率和片断大小、多少有关，较大的片断（7kb以上）回收率会有所降低，洗脱液预热到50度再加入纯化柱膜中央，有助于提高产率。

    除了比较适合个人使用的传统离心式，Qiagen还提供抽滤式的胶回收试剂盒，用抽滤的方法替代离心，使得实验可以连续进行，特别适合批量进行的需要——想象看，你只要将溶胶液加入装配好的抽滤管中，哗一下就抽干了，再加洗涤的试剂，哗一下又好了，多快呀！节约很多时间和功夫，不需要在离心机前面拿进拿出。以后的全自动操作模式就是这样的啦！

    看到这里可能大家都会说Qiagen的东西好是好，但是就是贵，一般的实验室都舍不得平时用，往往留着关键时刻做，不错，好东西自然不便宜，不过想要吃到便宜的午餐也不是不可能，目前生物通正在进行“看新闻，获Qiagen优惠券”的活动，半价只要实付600多就可以买到，实在划算，抓紧时机，赶快行动吧。（转下页）

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  ·胶回收之选全攻略（7）