胶回收方法全攻略(3)[选购宝典]

【字体: 时间:2006年07月17日 来源:生物通

编辑推荐:

  

胶回收方法全攻略(2)

胶回收方法之选全攻略

 

三、常规片断级的选择指南:所谓常规级,即回收片段大小介于100bp和10kb之间,在这个范畴内包含了一般的质粒或者克隆片段的回收。主流方法是柱回收试剂盒。

1. Qiaquick Gel Extraction Kit

品牌:Qiagen
回收范围:70bp-10kb
推荐指数:
价格指数:(50包装1,350,250包装6,372,约27元/反应,现有半价活动,价格非常可亲!)
特点:

  • 高达80%回收率

  • 操作快速简单,3步完成70bp-10kb片段的回收

  • 提供三色指示剂的电泳上样loading  Buffer,方便判断和操作

  • 回收产物纯度高,可用于同位素或荧光测序、芯片分析、连接转化、酶切、标记、PCR、显微注射、体外转录等后继实验

使用心得:

    Qiaquick最引以为傲的就是非常稳定的质量,高回收率和方便的步骤。产品质量的稳定可靠,一向是实验首要条件。毕竟,实验步骤是环环相扣的,每一步出现问题都会导致后患无穷,费时费力,还更费钱,对心情更是一种折磨。用试剂盒不就图省事和可靠吗?从核酸纯化领域起步的Qiagen,在全球实验室都享有极好的口碑,是值得信赖的选择。因为Qiagen有强大的研发队伍,精益求精优化实验操作的每一环节,绝非普通临摹制品、仿制品可比。以回收率为例,我们前面提到,由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响,所以回收率并非是一成不变的。所以Qiagen以严谨的态度提供多种条件下的详细介绍:

 

使用QIAquick回收之前和回收之后再混合的DNA片段 (大小已指出) 。对所有尺寸的片段均获得了接近80%的回收率。
1–5: 回收之前; P: 回收之后再混合。样品使用 1.5% 琼脂糖凝胶分析(TAE buffer)。
1–3: 回收之前; P: 回收之后混合。样品于 3.5% 高分辨琼脂糖凝胶上分析( TAE buffer)。M: pTZ-HinfI marker。

     记得《分子克隆II》里曾经说少于500ng的DNA几乎没有回收价值,看看上表就可以发现,现在的技术发展,即使是少到100ng的DNA还有70%的回收率呢!而且操作方法还很简单。

    虽然是几乎不需要实验技巧的简单操作,如果你注意到一些小技巧 还是很有帮助的。DNA回收纯度取决于纯化介质对DNA吸附的特异性、洗涤杂质是否彻底。而DNA回收率和浓度则与elution buffer的体积,以及buffer在柱子上停留的时间有关。较大的洗脱体积可以提高回收率,充分洗脱,但是会造成产物浓度太低不好用。比如100-200ul的洗脱液可以彻底洗脱纯化柱吸附的DNA,不过考虑到后继实验的方便,Qiaquick建议使用50ul的洗涤液,正对加入膜中央(避免加在管壁上而不能充分接触纯化介质),可以完全浸润回收柱上的纯化膜。最低建议采用30ul洗脱液,但是可能会降低回收率。有人试过用15—25ul洗脱2次,觉得这样第一次浓度高第二次比较充分,其实没有必要,只要适当延长在柱上停留的时间,就有助于提高得率——Qiagen的Protocol说明,30ul停留1分钟要比50ul停留1分钟回收浓度高1.7倍。充分离心(保证速度和时间)有助于提高得率和纯度,减少残留对后继实验的影响(这个方法要注意不是所有试剂盒都可以使用,因为有些试剂盒的纯化柱填料松一些,离心有时可能导致少量填料脱落,而Qiagen的这个产品是膜式的,结合非常牢固,据生物通线报,中大有人用这个柱子高温消毒后重复使用,效果不赖,可见皮实。当然这是厂家绝对不推荐的)。

    其他的技巧也是大家熟知的,比如切胶的时候要尽量减少切胶体积(不超过400mg),由于Qiaquick柱子的载量达到10ug,如果胶块实在太大而预期DNA总量不超过10ug,可以用大一点的管溶解,分几次上柱离心吸附后再洗涤。注意的是紫外照射时间不要太长,因为紫外线对DNA(特别是对于较大的片段)有影响。还有就是溶胶要彻底,用枪头把胶块弄碎一点有助于50度下快速溶解。溶解完全后溶液的颜色指示溶液的pH值,如果变色需要调pH值以防止实验失败。需要用ddH2O或者TE洗脱的,注意pH在7.0—8.5之间的回收率最高。回收率和片断大小、多少有关,较大的片断(7kb以上)回收率会有所降低,洗脱液预热到50度再加入纯化柱膜中央,有助于提高产率。

    除了比较适合个人使用的传统离心式,Qiagen还提供抽滤式的胶回收试剂盒,用抽滤的方法替代离心,使得实验可以连续进行,特别适合批量进行的需要——想象看,你只要将溶胶液加入装配好的抽滤管中,哗一下就抽干了,再加洗涤的试剂,哗一下又好了,多快呀!节约很多时间和功夫,不需要在离心机前面拿进拿出。以后的全自动操作模式就是这样的啦!

    看到这里可能大家都会说Qiagen的东西好是好,但是就是贵,一般的实验室都舍不得平时用,往往留着关键时刻做,不错,好东西自然不便宜,不过想要吃到便宜的午餐也不是不可能,目前生物通正在进行“看新闻,获Qiagen优惠券”的活动,半价只要实付600多就可以买到,实在划算,抓紧时机,赶快行动吧。(转下页)

  ·胶回收之选全攻略(4)
  ·胶回收之选全攻略(5) 
  ·胶回收之选全攻略(6:大片断的难题)
  ·胶回收之选全攻略(7)
 

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号