分子生物学篇之基因组DNA纯化[选购宝典]

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分子生物学篇之质粒DNA纯化

生物通技术盛宴8:蛋白研究之质谱选择

生物通技术盛宴7:蛋白样品浓缩沉淀法宝

生物技术盛宴6：蛋白纯化层析柱

2007技术盛宴5:蛋白样品制备中各类杂质/杂蛋白的去除

生物通技术盛宴4：蛋白酶抑制剂的选择

生物通技术盛宴3：磷酸化蛋白和糖基化蛋白的样本制备

生物通技术盛宴2：蛋白样本制备产品大PK

蛋白技术篇之蛋白样品制备

基因组研究的第一个挑战就是获得基因组DNA，无论你需要进行研究的DNA是来自于一张纸片的纤维，一个植物细胞的细胞壁，白细胞的细胞核，还是其它细胞类型的任何部位，首先要做的就是释放这些基因组DNA，然后将这些DNA从RNA，蛋白和其它复合物中分离出来。

在许多实验中都需要进行基因组DNA抽提，比如构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离：加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。

一般来说，构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异，一些特殊组织的DNA抽提由于组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。

然而尽管已有许多进行基因组DNA抽提的手工方法，但是有些样品来源或者由于其自身成分的原因，或者因为量少的原因，不易抽提，比如昆虫就是一种“臭名昭著”难以提取DNA的样品。因此一些商业的试剂盒确实在一些情况下是更好的选择，省时省事不说，对于后续研究也许也益处多多。

首先要提到的是Sigma－Aldrich公司的一些基因组DNA分离试剂盒，Sigma在基因组DNA提取方面还是颇有建树，其Extract-N-Amp一步式抽提与扩增试剂盒系列能在15分钟内抽提并扩增基因组DNA。

针对的样品包括动物组织，血液，植物叶子和种子，优点在于：

• 适用于快速的基因谱分析；
• 基于溶液方法的快速DNA抽提，无需离心、柱子或长时间的酶消化反应；
• 采用热启动PCR酶，特异性更好；
• RedTaq试剂，包含惰性染料，使PCR产物可以直接电泳，更方便、更快捷；
• 有SYBR Green I试剂盒可用于动物组织的直接定量PCR检测；
   

这个试剂盒之所以称为一步式抽提试剂盒就在于其抽提过程简单，仅仅抽提、稀释/中和和扩增三步反应，即将组织样品和Tissue Preparation Solution中加入Extraction Solution，室温下放置10分钟。然后95度/3分钟，加入Neutralization Solution。之后取出部分样品，加入Extract-N-Amp SYBR Green PCR ReadyMix和引物，移入定量PCR仪器进行扩增，就可以获得扩增曲线、溶解曲线，进行分析了。

除了这一用于PCR准备型核酸样品的提取试剂盒之外，Sigma还有一款超出传统PCR的局限的全基因组扩增试剂盒：GenomePlexTM Whole Genome Amplification (WGA)。

这一款试剂盒可以有效而精确的扩增纳克级的起始样本基因组DNA，得到微克级的DNA, 同时最大程度的避免等位基因的缺失。经过GenomePlex扩增的DNA适合各种下游应用，包括电泳、定量PCR、CGH芯片、STR分析、SNP分析和测序等。其特点为：

• 适用样本来源广，包括：全血、Blood card、血浆、血清、口腔拭子、植物、土壤、FFPE组织、单个细胞；
• 完好的基因组代表性，无可检测到的等位基因偏好性
• 专用的WGA DNA聚合酶是扩增的精确性更好
• 保护稀有的资源样本，在数小时内扩增纳克级的起始样本基因组DNA，得到微克级的DNA
• 广泛的下游应用：定量PCR、芯片分析、SNP分析和测序等
   

GenomePlexTM产品源于一项专利扩增方法，该方法的基础是把基因组随机片断化，形成一系列短且重叠的模板。这些短链的DNA形成一个3’端与5’端有特定序列组成的文库，称为OmniPlex文库。然后再进行线性、等温的起始扩增，继以有限循环数的基因组扩增（PCR）。常规的GenomePlex反应只需要很少的手工操作时间，可以在3小时内得到扩增的DNA。

（图解：GenomePlexTM WGA首先通过非酶促反应把基因组DNA随机片断化，然后把这些片断通过统一的连接子序列转化成为可PCR扩增的片断。）

另外成立于1978年的美国Promega公司的DNA提取试剂盒在基因组抽提方面有三类试剂盒：以磁性颗粒为基础的MagneSil系列试剂盒，以膜和溶液为基础的Wizard系列试剂盒（Wizard还有一种磁性96DNA植物系统试剂盒），以及以树脂为基础的ReadAmp试剂盒。

其中MagneSil® 血液基因组最大产率系统采用 MagneSil® 磁性颗粒技术在Beckman Coulter Biomek® FX自动化平台上高通量纯化DNA。从96个抗凝血样品中纯化DNA的全过程大约需要1小时。DNA的回收效率、纯度及PCR实验表明相邻孔的样品间没有交叉污染。纯化的DNA适用于常规PCR扩增、多重荧光PCR扩增 (例如PowerPlex 16® 系统)、Y染色体缺失检测试剂盒和READIT ® 系统的SNP基因分型等应用。产品的特点一是获得最大回收效率——从200μl血液中可纯化得到4-6 μg DNA，二是省时——纯化基因组DNA可轻易自动化完成。

而MagneSil® ONE，血液基因组DNA定量纯化系统可从60ml (+/- 50%)抗凝血中定量纯化1μg基因组DNA。纯化的DNA具有固定产率，省去了纯化后的DNA定量步骤及对DNA浓度进行标准化。纯化的高纯度DNA适用于PCR、多重PCR和SNP基因分型等应用。在在Beckman Coulter Biomek® FX（已获得BeckmanCoulter公司的许可）上可自动化纯化96孔板DNA 。程序开始后不需任何手工操作在1小时内完成96个样品的纯化。

MagneSil® ONE系统使用MagneSil® 磁性颗粒－固定产率作为“流动固定相”。和以柱为基础的纯化系统不同，核苷酸可以在溶液中结合到磁性颗粒上，结合动力学加快，结合效率提高。在纯化步骤的清洗过程中颗粒可以完全重悬，这样可以加强颗粒和清洗缓冲液的接触，并有效去除杂质，提高核苷酸的纯度。

MagneSil® 固定组织基因组DNA纯化系统可从福尔马林固定的、石蜡包埋固定组织中纯化提取基因组DNA，纯化方法快速、简单。经蛋白酶K过夜消化后，可在1小时内从福尔马林固定的、石蜡包埋组织切片中手工纯化提取基因组DNA。这一系统纯化前裂解液不需离心，可从10μm组织切片中纯化提取可扩增的基因组DNA。

除了MagneSil系列，利用磁珠的还有Wizard® 磁性96 DNA植物系统，这一系统采用手工或96孔板自动纯化植物叶子和种子组织中的基因组DNA，适用于谷物、番茄叶以及加拿大油菜和太阳花种子的DNA纯化，纯化的DNA可用于PCR以及RAPD分析等应用中。

Wizard® 磁性96 DNA植物系统采用MagnesilTM 磁性颗粒为流动固相，这和以柱为基础的纯化系统不同，核苷酸可以在溶液中结合到磁性颗粒上，结合动态更快，结合效率提高。在纯化步骤的清洗过程中颗粒可以完全重悬，这样可以加强颗粒和清洗缓冲液的接触，并有效去除杂质，提高核苷酸的纯度。MagnaBot ® 适配器T1是一个铝质夹，可将MagnaBot® 96磁性分离装置放置在Tecan Genesis RoMa微孔板托上。

而以膜和溶液为基础的Wizard系统也包括几种类型：Wizard® 基因组DNA纯化系统，Wizard® SV 基因组DNA纯化系统和Wizard® SV 96基因组DNA纯化系统。

其中Wizard基因组DNA纯化系统以溶液为基础，可从血液淋巴细胞、组织培养细胞、动物及植物组织、酵母、革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌中提取基因组DNA，纯化方法简单、快速。纯化得到的DNA可用于扩增反应、限制性酶切消化和膜杂交等多种应用。

系统优势：

• 灵活：从多种样品中提取的染色体DNA适用于多种 下游应用
• 快捷：在60分钟内即可从全血、组织培养细胞、动物 及植物细胞、酵母、细菌中提取基因组DNA
• 简单：操作过程只有4步，不需要有机溶剂的抽提
• 可放大：根据纯化样品的量可调整试剂用量

采用Wizard® 基因组DNA纯化系统从不同物质中纯化 DNA的回收效率 来源 起始物质的用量 DNA产率 全血 300μl 5-15μg 1ml 25-50μg 10ml 250-500μg 96孔板， 50μl/孔 0.2-0.7μg 组织培养细胞 106-107 细胞 5-30μg 动物组织 鼠肝 11 mg 15-20μg 鼠尾 0.5-1cm 尾 10-30μg 昆虫细胞 5 x 106 细胞 16μg 植物叶组织 40mg 7-12μg 细菌培养液 108-1010 细胞 5-20μg 酵母 1.9 x 108 细胞 4.5-6.5μg

最后一种以树脂为基础的ReadyAmp基因组DNA纯化系统可从血液或血斑中提取单链染色体DNA，所用方法简单、有效、安全和便宜。整个实验在1小时内完成，不需有机溶剂抽提或乙醇沉淀。ReadyAmpTM 基因组DNA纯化系统纯化的单链染色体DNA可直接用于PCR反应。系统优势在于：简单有效——系统以树脂为基础从血液或血斑中提取 DNA和方便——纯化的DNA可直接用于PCR反应。