用NanoDrop进行A205蛋白或多肽的检测

我们常用A280的方法来进行纯化单一蛋白的检测，因为对于大多数蛋白来说，都含有色氨酸、酪氨酸等具有苯环结构的氨基酸残基，而苯环结构则在280nm处有*高吸收峰。但是有一些蛋白或者多肽，不含有这些氨基酸残基，则无法用A280的方法进行蛋白检测了。在这里，我们介绍一种利用205nm处肽键的吸收峰，进行蛋白或多肽检测的方法，这种方法不受蛋白中氨基酸种类和含量的影响。

前言

基于吸收光检测蛋白浓度的方法里，用280nm的吸收光来检测的方法是*具代表性的，因为大多数蛋白中存在色氨酸、酪氨酸以及一些的半胱氨酸残基。相反的，某些蛋白或多肽可能缺少这些氨基酸残基，所以无法准确定量。

我们可以通过Scopes方法(Scopes, 1974)，将蛋白样本溶于无吸收光的溶液中，通过检测肽键在205nm处的吸光度，来进行蛋白样本的检测。Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c分光光度计利用205nm紫外波长，结合**的样本保留技术，能为多肽和蛋白的超微量检测提供灵敏的定量结果。

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创建新的自定义方法

1、运行NanoDrop™ 2000/2000c软件，在主界面上选择“Method Editor”按钮；

2、根据软件的提示，填入相关信息：
在Name & Type界面：
输入方法的名字(建议标题：A205 Protein&Peptides),描述;
选择方法的类型：“Manually entered factor / extinction coefficient”
填好后点击”Next”

3、Measurement界面：
分析波长：205nm；
测得的结果名称：浓度；
结果单位：mg/ml；
蛋白样本的分子量（以BSA为例）：66 kDa；
小数点位数：3位；
选择使用消光系数：31mg/ml
备注: 在205 nm的质量消光系数E0.1% (1mg/mL) = 31 (Scopes, 1974)
填好后点击“Next”

4、校正界面
在本实验中,分析校正：无
基线校正：340nm
填好后点击“Next”

5、添加检测方法：
无，所以无需添加。
直接点击“Next”

6、仪器设置界面：
选择检测范围：UV range (190 nm – 350 nm)
勾选“Auto pathlength (analysis wavelength)”
填好后点击“Finish”

点击左上角的“Save”保存该方法

当我们回到主界面时，在“Method Editor”中便有我们刚刚编辑的程序：

 
A205蛋白或多肽的检测

直接双击打开我们刚刚编辑的方法，基座检测或比色杯检测均可以用这个方法进行多肽或蛋白的检测（NanoDrop 2000c）。
按常规的方法检测即可：取2ul溶蛋白的缓冲液做“Blank”→取2ul溶蛋白的缓冲液做“Re-Blank”(建议) →充分混匀蛋白样本，取2ul检测“Measure”。
软件会自动根据我们设置的参数来计算蛋白的浓度。

参考文献：
Scopes, R.K. 1974. Measurement of protein by spectrophotometry at 205nm. Anal.Biochem.59:277-282.
Grimsley G. R., and Pace C. N. “Spectroscopic Determination of Protein Concentration” Current Protocols in Protein Science (2003) 3.1.1 –3.1.9. John Wiley & Sons, Inc.

欲了解NanoDrop在其他方面的应用，请参见：

“NanoDrop在蛋白检测中的应用专题”
http://www.ebiotrade.com/newsf/2014-1/2014114134415102.htm ，http://www.ebiotrade.com/newsf/2014-1/2014117142858920.htm ，http://www.ebiotrade.com/newsf/2014-1/2014117145009695.htm

NanoDrop在Real-time PCR中的应用
http://www.ebiotrade.com/newsf/2013-12/20131211160254263.htm

根据MIQE指南对qPCR和RT-qPCR进行核酸的质控
http://www.ebiotrade.com/newsf/2013-12/20131211161124625.htm

如何避免植物样本核酸提取时多糖的残留？
http://www.ebiotrade.com/newsf/2013-12/20131211161511475.htm

用NanoDrop进行小分子药物的质控
http://www.ebiotrade.com/newsf/2014-3/2014321112543538.htm

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