专家指南：实时定量PCR关键要素[心得点评]

生物通收集编译世界各地多位Real-time PCR专家们在多年实验的经验之谈，就荧光实时定量PCR技术中5大关键问题畅谈个人心得，希望能对您的实验有所帮助。

    生物通编者按：实时定量PCR技术在科学应用上被誉为一门艺术。实时荧光定量PCR技术一直没有真正的实验标准，不同实验平台上得到的结果之间可能完全没有可比性。前段时间生物通推出的生物技术专题“定量PCR技术报告”系列文章受到了读者的关注。在此基础上，生物通收集编译世界各地多位Real-time PCR专家们在多年实验的经验之谈，就实时定量PCR技术中5大关键问题畅谈个人心得，希望能对您的实验有所帮助。记住，本文并不打算告诉你什么是最好的或者是正确的观点，即使专家们的看法也各有不同，本文仅仅是提供多位定量PCR老手的看法供你参考借鉴，从中取其精华结合自己的观点才是真正重要的。

Q1: What are your criteria for high-quality RNA?
Q2: What pre-amplification methods have you applied and validated?
Q3: How do you measure intra- and inter-assay variation?
Q4: What do you consider when selecting your quantification strategy?
Q5: What standards and templates do you use?

一、real time RT-qPCR技术要点之一：什么是高质量RNA标准？

    real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。好的开始是成功的一半，获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的RNA，对于其后的定量结果，自然是非常重要的。

Mikael Kubista，教授, R&D TATAA Biocenter主任：
    RNA质量包含两个方面：样品的纯度和RNA的完整性。样品纯度可以在样品稀释时得到改善。我们通常通过Nanodrop测量吸光值来检测纯度。260/280吸光值的比率应该在2至2.1的范围内，并且是“漂亮”的吸光光谱曲线。230nm吸收峰应该低。我们通过利用Experion (Bio-Rad)记录电泳图（electropherogram）检测RNA的质量。当然，最理想的结果是得到很清晰的18S和28S峰值。但RNA的完整性是无法改善的，保存样品、固定样品和来源于富含降解酶的器官的样品RNA完整性通常不好。检测RNA质量的两个原因，一是想要知道某一个实验得到的RNA质量，从而选择适当的RT-qPCR方法，二是识别出研究中的样品的质量是否比正常情况差，避免导致偏差或者不正确的结果。

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心
    高质量的RNA应该是完整的、不含抑制剂的。我们习惯利用毛细管凝胶电泳系统来评价28S和 18S条带的比率，过程很快速并且只需要很少量的RNA。值得注意的是，这个比率是组织或者细胞特异的，所以理想的是你应该将样品与一个同样细胞来源的完整对照比较。在芯片分析（微阵列研究）中通常都要求进行RNA质量分析，现在许多定量PCR领域的人们开始考虑RNA质量这个因素。我们最近在发表的文章说到评价用于PCR分析的RNA的质量尤为重要，这是由于并非每个基因降解水平都相同，严重时甚至可以使你的实验结果出错(Perrez-Novo et al., 2005)。我们主要的结论是：参考基因(reference gene)的稳定性在完整样品（intact）和在降解样品中是有差别的，因此你不应该将完整的样品和降解的样品相比，尤其是你在研究精确的表达差异时。

    检测核糖体吸收峰值是目前评价RNA完整性的金标准，但其实rRNA仅是mRNA成分完整性的一个代言标记。我们开发了一种基于PCR的分析实验，可以比较一个特定基因的5'和 3' 端amplicons的比率。通过比较未知样品和完整的对照样品的比率，我们能够利用PCR分析实验衡量mRNA的完整性，与电泳评估/rRNA评估相比更具有直接相关性。

    为了评价制备RNA的纯度（例如没有抑制剂），我们实行qPCR SPUD分析，既简单易用又免费(Nolan et al., Anal Biochem, in press).

Tim Hunter，英国伦敦大学学院（UCL）：
    你需要建立灵活的操作流程来分离高质量的RNA。样品类型决定着哪一种分离方法是最好的。通常，初步的质量监控检查是在NanoDrop 分光光度计进行核酸定量的时候，260吸收峰外的读数值可指示污染情况。260/280的比率应该在1.8 至2.1的范围内。同样非常关键的，是要保证实验所用的RNA质量（全长、完整性）不打折扣，因此，我们通常利用Agilent 2100 Bioanalyzer检查RNA的完整性，并根据rRNA峰值的完整性判断RNA样本的情况，选择下一步实验适合的方法。假如有证据显示重要样品有降解，我们会同时检测一个在该样品中已知稳定的管家基因，来观察是否出现由于转录产物不完整而导致管家基因在这个样本中的表达改变。当探针并非处于外显子—外显子边界时，我们会同时选择中/高表达的管家基因作(-)RT对照，以检查基因组DNA的污染情况。样品可在37ºC下孵育2-4小时，并重新在Bioanalyze上分析降解情况，以检查核酸酶的活性。

Cristina Hartshorn,美国Brandeis大学生物学系：
    我认为高质量RNA是指正确代表细胞内容物的转录池（transcript pool）的RNA。我们实验室非常注重RNA的回收率，尤其是来源于像单个细胞等的微量样品中RNA的纯化，需要尽量减少可能导致核酸降解的操作步骤。因此，我们开发了一种能在同一支试管里连续进行收集细胞、裂解细胞、去除蛋白杂质、逆转录和实时定量PCR等操作的整体流程。这种整个实验在单个试管内进行的方法称为PurAmp (Hartshorn et al., 2005a; Hartshornet al., 2005b)，该方法基于稀释法，并且不需要将RNA结合到任何纯化基质上去，因此保证了实质上纯化得到完整的RNA库。此外，我们觉得转录产物的完全去蛋白化对于RT引物与模板的正确结合、以及最终模版定量的精确性和可重复性来说是十分必要的，这就像对基因组DNA模板制备来说是必需的一样。

    PurAmp方法有时要求一个DNase消化的步骤，但是我比较喜欢避免这一步。我尝试过多种DNase操作方法，但结果总是发现回收的RNA比预期的少。这可能是因为最后一步高温失活酶的步骤导致了RNA的水解。一些商品化的手册表明经过“+ / - DNase”处理后的实时PCR循环，特定样品的信号会出现几个循环的Ct漂移（shift）。其实，考虑到每个细胞中特定的基因的拷贝数比该基因表达时的转录产物的拷贝数少得多，这种漂移几乎是难以察觉的，因此，不应该在DNase消化后稀释模板数量。我喜欢一起扩增DNA和RNA模板，最后消减去基因组DNA的拷贝数（详细请见Question 5）。

Jim Huggett，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    我们在英国的实验室通常利用Agilent Bioanalyzer评估核糖体RNA条带来评估纯化RNA的质量。然而，由于我们在撒哈拉以南的非洲国家开展许多研究工作，这里仪器缺乏，所以我们要用琼脂糖凝胶电泳来评价rRNA，从而告诉我们核糖体RNA条带是否OK，以及我们的RNA提取工作是否有效；然而，越来越多证据表明，这些rRNA条带的降解不一定意味着mRNA降解。用什么方法进行质量评估是个人的喜好，现有的评估方法还是必需的。

Xiuling Zhang,纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center:
对于从人类组织中分离的RNA样品来说，我的高质量RNA标准是：
1． rRNA 比率 [28s/18s] ≥ 1. 1, RNA完整系数 (RIN)≥ 7 (利用Bioanalyzer 2100进行分析)
2. 28s和 18s 条带明显(变性琼脂糖凝胶电泳)
3. 比率 [260nm/280nm] ≥ 2.0 (分光光度计测量).

（待续，生物通编者亚历，版权所有谢绝转载）

专家指南：实时定量PCR关键要素(2) 

专家指南：实时定量PCR关键要素(3) 

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