专家指南：实时定量PCR关键要素(3)[心得点评]

续前：

专家指南：实时定量PCR关键要素

专家指南：实时定量PCR关键要素(2)

实时定量PCR操作要点之四：选择做定量PCR时，需要注意哪些因素？

Cristina Hartshorn，美Brandeis大学生物学：
    我想细心的引物设计对于得到专一高效的模板扩增反应来说是十分必要的。研究人员可以利用新出的改进型软件程序来达到这个目的。我们实验室专注于高质量PCR （high-quality PCR）的研究，并已经设计了一系列防止错配和引物二聚体发生的试剂(Elixirs, 专利申请中)。我们一般最后用测序来证实扩增子（amplicon）的特异性。因为我们采用LATE-PCR 和RT-LATE-PCR，产生的扩增子是单链的，测序尤为方便。

Jim Huggett，英国伦敦大学学院（UCL）：
    我们的多数工作是在发展中国家开展的，那里的实验室缺乏高科技设备，要求研究人员在几乎没有怎么经过训练的情况下操作各种需要实验技巧的工作。因此我们的定量方法很简单：用已知拷贝数的标准做“绝对定量”，得到大概的拷贝数——这种方法对于非分子生物学专业的人来说比较容易掌握。此外，通过做出标准曲线，我们能自动的将实验分析效率的评估整合到报告的结果中去——这是当简单处理delta-Ct时通常会忽略的因素。

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    实验室通常根据待检测的类型和需要考虑的因素来决定选择哪一种定量系统。比如，要定量一种组织样品中的细菌量，通常会选择定量PCR的标准曲线法。根据已知的拷贝数产生的标准曲线，作为“绝对定量”的标准来衡量未知样品中的目标数量。这里，实验的灵敏度——也就是检测低拷贝的下限（甚至低至单拷贝）——是关键因素，灵敏度高才能检测极为微量的细菌含量。

    当为基因表达分析实验选择一种定量方法时， 往往需要确定目的基因和看家基因的扩增效率是否相近，当二者的PCR效率不能匹配因而无法比较定量的Ct值时，就需要重新设计引物，或者采用一些相关的定量方法，通过产生相对标准曲线来弥补扩增效率的差异。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    定量方法的选择在很大程度上取决于我们的研究目的。由纯化模板或者PCR产物很容易得到标准曲线，但它们不是十分的可靠，因为没有考虑到基质效应（matrix effect）。假如需要确定一种样品中某种mRNA的量，应该加入以体外转录的目标mRNA为标准溶液，以标准添加法 ( Standard Addition Method )进行定量。在模版足量的前提下系列稀释来减低基质效应。这种方法的问题是反应体系中污染物也会被稀释，导致PCR效率随之改变。对于相对定量反应，当一个定量实验中有一对作用相反的基因，其相对表达量能够被非常准确地测量，可能成为疾病标志物(Ståhlberg et al.2003)。只有一种报告基因，它的表达量需要用一种或者更多已验证的参考基因来平衡(normalized)。可以借助一系列的对照基因组和软件（如GeNorm）来进行分析。假如实验目的只是对样品归类，如疾病的阴性/阳性诊断，最好是检测多个报告基因的表达（不需要用参考基因），用基于表达模式的分类方法进行判断（如GenEx软件）。

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    在验证相关的分析方法和评估过样品的质量后，我们首先要做的步骤是确认候选的参考基因，另一个重要因素是尽可能减少实验偏差，这通过“样品最大化”设置很容易实现——所谓“样品最大化”是指将全部或者尽可能多的样品放置到同一块板中。与此相反的另一种实验设计思路是在同一块板上放置尽可能多的不同基因以进行同时检测，这就需要设置适当的批间校准来平衡不同批次实验之间的差异。在实验后，我们会用我们的免费软件qBase处理数据，这个改良的方法是基于已经确证过的delta-Ct方法，内置基因特异的效率修正和多参考基因的平衡化。

Marisa Wong，奥克兰儿童医院（Oakland Children's Hospital）：
    我认为定量方法的选择主要是实验人对数据的偏好。例如，一些人觉得很难理解或者表达得到的Cts数据，因此更倾向于利用标准曲线。

Xiuling Zhang，纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center：
    首先要考虑的是定量研究的目的——是检测绝对的拷贝数还是相对的拷贝数。
    第二要考虑是否需要标准参照和所用的标准的类型。
    第三要考虑打算利用什么标准化的因素（normalization factor）。
    第四要考虑定量实验的细节，如引物设计和防止DNA污染物等。

 

实时定量PCR操作要点之五：选择什么样的标准和模板？

Cristina Hartshorn，美Brandeis大学生物学：
    在我做的基因表达研究中，我总是选择在目标基因外显子内部设计引物对，这样在PCR过程中基因组DNA和cDNA序列的扩增产生相同的产物。这种策略使我能够通过稀释商品化基因组DNA进行定量得到标准曲线，通过比较来确定样品中模板的数量。PCR的效率对于标准品和未知样品来说是一样的，因为用于扩增的引物和模版在两种情况中是一致的。

    这种方法对于没有内含子的基因和有内含子基因都同样可用，其优点包括无需额外的实验就可以定量RNA和DNA；在无表达的情况，DNA的存在对于证实PCR实验本身没有问题是十分有用的；因此，再加上DNase处理会带来的问题，我更趋向于保留样品的DNA，同时扩增RNA(cDNA)和基因组DNA，然后从这种“总的模板拷贝”消减去基因组DNA的拷贝数，从而计算出mRNA拷贝数。基因组DNA的拷贝数可以通过分析与“经过逆转录的样品(+RT)”相平行的 “未经逆转录反应的样品(No RT)”样品来检测得到，但在研究单个细胞的时候不需要这样做，因为单个细胞的基因拷贝数是已知的。此外，基因组DNA的存在可以证实细胞被成功转移到试管，证实不是人为操作失误造成无表达的结果。(see Hartshorn et al.,2004, for more details).

Jim Huggett，英国伦敦大学学院（UCL）：
    我们在所有的定量实验中都使用标准品（报告中使用绝对拷贝数）。我们的模板是克隆到载体上并线性化的模版。为了使得实验条件尽可能的相似，我们在全部反应（包括参照、标准品和未知样本）中添加了250 µg/ml tRNA。

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    我们通常利用标准品获得标准曲线来确定未知样品的量。标准品的选择根据研究目的和需要的精确度决定。我们常使用已知拷贝数或者分子数的质粒得到绝对标准曲线。对于相对定量来说，我们常选择靶标基因高表达的样品进行提梯度稀释（覆盖３到６个对数级，取决于所需要的灵敏度）。我们过去也利用浓缩的PCR产物作为标准品，但要特别提醒使用这种方法的人们尤其需要谨慎，因为这种方法很容易污染你工作的地方或者工具。因此我们很少利用PCR产物作为标准品。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    在定量实验的过程中我们利用标准品作为质量对照。因此，纯化的PCR产物可以作为标准品。但纯化的模板不是十分适合的标准品，这是由于与在首轮PCR中占支配优势的天然模板相比，PCR产物短，并且导致扩增效率不同。线性化的质粒是一种更好的选择，但仅合适DNA定量。对于RNA定量来说，利用RNA标准品更优。通用参照RNA（Universal Reference RNAs）是一种选择。我们密切关注External RNA Controls Consortium的工作，他们正在验证140种对照序列，其中部分是人工合成的。

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    在自动化流程进行silico qPCR分析的评估中，我们通过标准品来确定qPCR分析的效率。我们利用系列稀释的基因组DNA或者Stratagene 公司的QPCR Reference Total RNA（从每个实验64ng到0.0625ng）进行三重平行实验。为了尽量减少试管对低拷贝数模板的吸附，泊松样品效应（Poisson sampling effects）和自动水解，我们在10 ng/µl λ噬菌体载体DNA里稀释模板。显然，基因组DNA标准品只能用于引物对不跨越内含子的情况下。通常我们也尽量这样设计引物，因为这就可以利用基因组标准品，在未知基因是否表达的情况下还可以用于直接验证PCR反应条件本身是否成功。

    最近，我们也有利用长链寡核苷酸序列作为标准品模板，同样也要稀释在载体DNA中。

    在利用系列梯度稀释方法来决定PCR效率的时候，需要指出的是：尽管这种方法仍然被当作金标准，几乎没人去计算评估效率的错误，或者在下游计算的不确定性。有趣的是，这公式本身清楚地指出怎样尽可能减少误差：扩大稀释度和建立更多的稀释点。我们那个免费的自动qPCR数据分析管理软件qBase能计算这种误差，用用于进一步的计算。

Marisa Wong，奥克兰儿童医院（Oakland Children's Hospital）：
    我的每一个实验都要设立标准品，这种标准品通常是源于cDNA的模板、包含目标区域的扩增产物。   

生物通在这里再次强调，本文并非要提出最佳或者正确的定量PCR之路，到目前为止也不存在全球公认的定量PCR标准。急于寻找“标准方法”的读者看完可能还是觉得依然云里雾里。研究方法从来没有最好，只有最适和自己实验的方法。他山之石可以攻玉，看看定量PCR老手们的不同见解，国外实验室的一些常用做法，对于想深入考究定量方法的人来说是有益的，对于只想快快借助定量PCR拿到一个结果，恐怕要失望了。

（生物通编译，未经许可谢绝转载）

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