专家指南：实时定量PCR关键要素(2)[心得点评]

实时荧光定量PCR技术一直是个令人琢磨不定的难题，不同实验平台上得到的结果之间可能完全没有可比性。生物通收集编译部分定量PCR老手就定量PCR技术5个关键问题的看法，记住，本文并不指望告诉你什么是最好的或者是正确的观点，即使专家们的看法也各有不同，本文仅仅是提供不同专家的看法供你参考借鉴，从中取其精华，结合自己的观点才是真正重要的

续前：专家指南：实时定量PCR关键要素

实时定量PCR技术要领之二：你选择哪种有效的预扩增方法？

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    目前，对于低丰度目标样品或者低回收率的核酸，我们不需要使用预扩增（pre-amplification）步骤来产生足够的起始材料。我们在逆转录反应中设计的一种特殊的引物策略通常能解决目标样品的低表达问题。目前市场上已经有几种系统能很好地解决样品的低表达问题，但确证预扩增步骤不会在实验分析中产生偏差，对于实验是非常之关键的。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    我们参与[NuGen公司的] Ovation mRNA扩增技术的多实验室验证，以及[ABI公司的] TaqMan PreAmpMaster Mix Kit（用于在qPCR前预扩增cDNA）的Beta 测试。两个产品我们用起来都不错。我们用后一种产品来研究单个细胞内多种基因的表达。所有扩增子的引物都加入样品中，浓度远低于常规PCR，进行14个循环的预扩增后停止反应，反应产物被稀释并用作第二次PCR反应的模板，第二次PCR每个反应使用单对引物和探针。一次可以平行预扩增多达100种目的基因。最直接检测预扩增效果的方法，是选择一些浓度较高的样品，同时平行地进行预扩增和直接扩增，从而比较多个基因的表达模式（比率）是否得以保留。我们同样也利用一种高表达基因，如18s作为预扩增的内参（internal control）。

 Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    我们评估了几种全转录组（whole-transcriptome）扩增方法，包括基于T7 RNA聚合酶的线性RNA扩增方法和基于PCR的指数扩增方法。我们最重要的质量指标，是扩增前后样品之间的基因表达比率的一致性，倒不是基因之间的一致性。由于不同转录产物的扩增效率不同，多数扩增方法都会带入由此而引起的偏差（这种偏差通常是可重复的），这就意味着你不能简单地在预扩增后比较基因的表达水平——就算不进行预扩增，而采用直接扩增，这种比较本来也是困难的，可能有偏差的）。幸好，好的试剂盒或多或少能够保持样品之间表达率的一致性，这正是目前我们最关心的东西。除了全基因组/全转录组预扩增方法外，最近出现的其他方法，首先对一组挑选出来的基因进行循环次数有限的预扩增步骤，紧接着稀释产物并对每个目标进行单基因检测。对于已知预定目标基因的研究来说，这些方法显得更适合。

 

定量PCR操作要点之三：怎么衡量inter-assay和intra-assay间的差异？

    荧光实时定量PCR的所谓“定量”需要借助已知拷贝数的参照进行比较，或者比较不同目标之间的信号进行相对定量，这种比较的前提是各目标的反应条件的一致性，对于灵敏度如此之高的反应来说，两个样本之间反应条件的毫厘之差就可能影响结果。事实上，不同批次、不同反应管之间都很难做到“所有”反应条件完全一致，比如各成分的浓度，比如仪器的系统误差如96孔板加热的边缘效应、逐个孔读数（PMT）的时间积分问题或者是CCD读数的光程差距和干扰问题等等，都可能导致inter-assay（批间）和intra-assay（批内）间的差异。不同实验平台上得出的数据之间没有可比性、可重复性。如何评估这个差异呢？

Cristina Hartshorn，美Brandeis大学生物学：
　  LATE（Linear-After-The-Exponential，指数后线性扩增PCR技术是由Brandeis大学Wangh发明的一种不对称PCR新技术）PCR技术的发展为我们提供了更灵敏的新工具来监控实时定量PCR实验中的inter-assay和intra-assay的差异。LATE-PCR能高效地产生单链的扩增子（amplicons），很有优势(Sanchez et al.,2004; Pierce et al., 2005)。

    我们近期的基因表达研究采用了LATE-PCR技术。线性扩增使得我能够同时检测单个细胞的多个转录本，哪怕这些转录产物的量差别很大。在传统的对称双重PCR（duplex PCR）中，高丰度的转录本（模版数多）具有扩增优势，很快荧光信号达到了平台期，这时PCR反应物池中的成分可能在某种程度上已经大量消耗，因此可能降低了第二个转录本，或者说低丰度模板扩增的效率。相反，在实时LATE-PCR分析中，所有的扩增子线性累积，并且所有的荧光信号具有一个不变的斜率，直到反应终止，不会达到平台期。这种策略保证了不同丰度的多种mRNAs的共同扩增和可靠定量。

    我发现实时LATE-PCR过程中荧光信号连线的斜率（slopes）对监控intra-assay的差异极为灵敏，因为它们会受到反应中的很细微差别的影响而变化，而这中细微的变化在对称PCR中是无法觉察的。这对我的工作很有帮助，因为我在同一试管里通过稀释来进行细胞裂解、反转录和PCR。我觉得考查LATE-PCR和RT PCR联合使用的这些特点是非常有意义的，因为这使得最终定量基因表达成为可能。

Jim Huggett，英国伦敦大学学院（UCL）：重复实验来平衡差异

    我越来越觉得intra-assay的差异其实没什么意思，尽管这很容易检测。因为如果你的PCR方法是通用且高效的话，实际上不会带来多少的变异。

    inter-assay差异，才是真正的问题所在，尤其是RT-PCR。这不仅是由于样品的生物差异性，而且还由于cDNA合成的过程中涉及多个步骤，特别容易引入误差。因此我更愿意通过平行重复实验来平衡大部分差异，例如：理想的是从提取样品前，就每组的数量，平行重复实验。这当然需要花费更多的工作和金钱，但你的发现结果将会更有代表性。

Tim Hunter，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：
    外参和内标通常可以用于衡量一段时间内实验的可重复性。外参可以是实验室制备的样品或者是从制造商购买来的参照。比较不同时期同一实验中标准参照的数据偏差，就评价inter-assay和intra-assay的差异。

Mikael Kubista，Professor, R&D TATAA Biocenter主任：
    inter-assay的差异可以通过所有qPCR中添加一个相同样品来评估，确保Ct的标准偏差并不比同一板上的两个重复样品的标准偏差大很多。

    intra-assay差异（批内差，孔间差）由重复样品来监控。重复样品应该尽可能在实验初期就开始设置，从而尽可能更多地反应样品间的差异。相比于逆转录反应的偏差，qPCR的技术偏差其实无关紧要（Ståhlberg et al., 2004），包括样品抽提的误差的影响也比qPCR大得多。样品采集也可能是偏差的一个重要来源，尤其当分析组织样品的时候——因为多数组织材料是包含不同类型细胞的混合样品。最佳的情况当然是利用激光显微切割来收集同源的样品材料——即使是这样也应该收集几份样品便于比较。如果采集的样品非常微小——比如激光显微切割出来的几个细胞，那么单个细胞之间的本身的表达差异将变得十分显著(Bengtsson et al., 2005).

Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心：
    对于基因表达分析来说，我们在同一板上进行复制反应，并且利用平均量化循环值和标准误差进行计算 。在进一步的计算中，我们利用delta方法来传导误差，最终在具有各自相应的误差的情况下得到正常和重新调整的相对数量，反映分析间变异。值得指出的是，不需要在同一个板上测试参考基因和目的基因。这些是独立的分析实验，并且相互之间没有任何的联系。分析内差异或者 run-to-run差异是通常被低估一类变异。许多人们相信，量化循环值是一个绝对值，并且可以在实验运行之间进行比较。然而，这个值仅仅在一种特殊的运转或者平板中有意义。为了比较不同板上得到的结果，一个板需要一种inter-run校准器（calibrators），例如在两个板（同样的阳性对照、未知样品、或者标准稀释点）上测试模板。inter-run校准器使用的越多，板就会得到更精确和准确地校准。当然，误差在校准过程中适当的传导。

Marisa Wong，奥克兰儿童医院（Oakland Children's Hospital）：
    我通过同一块板上的三个重复样品的平均偏差来平衡intra-assay孔间差。在同一实验中，每一块板上重复同一系列标准参照来平衡批间差。

Xiuling Zhang，纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center：
    我们通过用相同样品平行重复两次或者更多，计算平均Ct、标准偏差和变异系数，从而衡量孔间差。定量PCR实验中，每个样品平行重复两次或者三次，假如循环数（Ct）在两次或者三次反应之间的差异小于0.5的话，我们认为变异可以接受，直接用平均Ct作为结果。

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专家指南：实时定量PCR关键要素(3) 

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